Orientadora : Drª Claudia N. Duarte dos SantosTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 22/03/2010Bibliografia: fls. 169-203Área de concentração: Biologia MolecularResumo: A dengue é hoje a principal arbovirose tropical, em termos de morbidade e mortalidade, e é transmitida ao homem através da picada de mosquitos do gênero Aedes. O vírus da dengue pertence à família Flaviviridae, gênero Flavivírus e possui 4 sorotipos (DENV1-4), e até o momento não existe uma vacina disponível ou tratamento especifico para a dengue. A infecção por qualquer um dos sorotipos pode causar desde quadros assintomáticos, febre clássica da dengue, ou ainda casos graves da doença, com eventos hemorrágicos, e eventualmente óbito. Dados recentes têm demonstrado que o perfil das manifestações clínicas da doença tem modificado nos últimos anos, e o aparecimento de episódios de encefalite associados à infecção pelo DENV tem aumentado significativamente. Com o intuito de estudar a neuropatologia associada à infecção por DENV, Desprès et al. (1998) e Bordignon et al. (2007), utilizando modelo murino, geraram variantes de DENV1 altamente neurovirulentas, que se replicam eficientemente no SNC de
camundongos. Os determinantes genéticos potencialmente responsáveis pelo fenótipo neurovirulento dessas variantes virais mapeiam nas proteínas E (E402 e E405) e NS3 (NS3- 209, NS3-435 e NS3-480). Para confirmar o envolvimento dessas mutações e visando compreender alguns aspectos dos mecanismos moleculares envolvidos na neuropatogênese da dengue, foram gerados clones infecciosos recombinantes contendo cada uma das mutações isoladamente ou em conjunto. Os vírus gerados a partir desses clones foram avaliados quanto ao seu potencial de replicação em células de inseto, infectividade no SNC de camundongos Swiss neonatos, modulação de resposta imune e análises histopatológicas do tecido cerebral de animais infectados. Foi observado que os vírus contendo as mutações NS3-435, NS3-480, 405/NS3-435 ou E402/NS3-480 eram capazes de provocar sintomas similares aos das cepas neurovirulentas em camundongos, como sinais de encefalite e paralisia parcial dos membros inferiores. Os grupos de animais infectados com os outros vírus recombinantes exibiram comportamento normal, sugerindo que as mutações NS3-435 e NS3-480 desempenhem um papel importante na neuropatogênese da dengue em camundongos. A replicação viral no SNC, avaliada por qPCR, foi maior nos animais inoculados com os vírus E405/NS3-435 e E402/NS3-480, que tiveram altas taxas de mortalidade. Além disso, os mesmos rupos de animais apresentaram uma maior modulação na transcrição de genes relacionados à resposta imune inata. Esse conjunto de dados indica que esses vírus são capazes de se replicarem de forma eficiente no SNC dos animais, desencadeando uma resposta imune exacerbada que está provavelmente envolvida na imunopatogênese da dengue. As análises histológicas das amostras de tecido cerebral dos animais videnciaram a presença de infiltrado mononuclear em vasos, necrose neuronal, nódulo microglial, além de meningite, moderada a aguda, em todas as amostras, sendo os danos de maior extensão nos animais noculados com os vírus E405/NS3-435 e E402/NS3-480. Os resultados gerados neste trabalho indicaram que vírus recombinantes contendo mutações pontuais no domínio helicase da proteína NS3 apresentaram maior habilidade de replicação e produção de partículas virais infectivas no SNC urino, causando encefalite e altas taxas de mortalidade. A geração de vírus contendo a dupla de mutações nas proteínas helicase e E, parece potencializar este efeito aumentando o dano no SNC, a resposta imune e a taxa de mortalidade dos animais. Atualmente estamos avaliando o comportamento biológico de novos vírus recombinantes exibindo diferentes aminoácidos na posição NS3-480 e estudando a interação da NS3hel com fatores virais e celulares, visando desvendar alguns aspectos relacionados à neuropatogênese da dengue.Abstract: Nowadays, dengue is the main tropical arbovirus in terms of morbidity and mortality and is transmitted to humans by the bite of mosquitoes of the genus Aedes. The dengue virus belongs to the family Flaviviridae, genus Flavivirus, and has 4 characterized serotypes (DENV1-4), and so far there is no vaccine available. The infection by any of the serotypes can cause asymptomatic cases, classical dengue fever, or severe cases of the disease, hemorrhagic events, and eventually death. Recent data have shown that the profile of the clinical manifestations of the disease has changed in recent years and the number of episodes of encephalitis associated with DENV infection has increased significantly. In order to tudy the neuropathology associated with infection by DENV, Després et al. (1998) and Bordignon et al. (2007), using a mouse model, generated DENV1 variants highly neurovirulent, which replicate efficiently in the CNS of mice. The genetic determinants potentially responsible for the neurovirulent phenotype of these variants map in the E protein (E402 and E405) and NS3 (NS3-209, NS3-435 and NS3-480). To confirm the involvement of these mutations and trying to understand some aspects of the molecular mechanisms involved in the neuropathogenesis of dengue, infectious recombinant clones were generated containing each mutation alone or in combination. Viruses generated from these clones were assessed for their potential of replication in insect cells, infectivity in the CNS of newborn Swiss mice, modulation of immune response and pathological examinations of brain tissue from infected animals. It was observed that viruses containing mutations NS3-435, NS3-480, E405/NS3-435 or E402/NS3-480 were able to cause similar symptoms to the neurovirulent strains in mice, as signs of encephalitis and partial paralysis of limbs. The groups of animals infected with other recombinant viruses exhibited normal behavior, suggesting that mutations NS3-435 and NS3-480 play an important role in the neuropathogenesis of dengue in mice. Viral replication in the CNS, evaluated by qPCR, was higher in animals inoculated with the virus E405/NS3-435 and E402/NS3-480, which had high mortality rates. Moreover, the same groups of animals showed a greater modulation in the transcription of genes related to innate immune response. This set of data indicates that these viruses are able to replicate efficiently in the CNS of animals, triggering an exacerbated immune response that is probably involved in the immunopathogenesis of dengue. Histological analysis of samples of brain tissue of animals showed the presence of mononuclear cells in blood vessels, neuronal necrosis, microglial nodules, and meningitis, moderate to acute, in all the samples, and the larger damage was observed in the animals inoculated with the virus E405/NS3-435 and E402/NS3-480. The results generated in this study indicated that ecombinant viruses containing mutations in the helicase domain of NS3 protein showed higher ability of replication and production of infective viral particles in the murine CNS, causing encephalitis and high mortality rates. The generation of viruses containing double mutations in helicase proteins and E, appears to enhance this effect by increasing the damage in the CNS, the immune response and the mortality rate of animals. We are currently evaluating the biological performance of new recombinant viruses exhibiting different amino acid at position NS3-480 and examining the interaction of NS3hel with viral and cellular factors, in order to uncover some aspects related to the neuropathogenesis of dengue
