Regulation of ARTD1 by SET7/9-dependent methylation

Abstract

Proteins are essential structural and functional components of cells and catalyze a multitude of biochemical reactions. Many proteins are subject to post-translational modifications in order to regulate their function and enzymatic activities. ADP- ribosylation of proteins is catalyzed by ADP-ribosyltransferases, which transfer one or more ADP-ribose molecules from their co-substrate NAD+ to their target proteins. The best-studied mammalian ADP-ribosyltransferase is ARTD1 (also called PARP1), a nuclear enzyme, which binds to and is activated by damaged DNA and poly(ADP- ribosyl)ates itself and other proteins. SET7/9 is a lysine methyltransferase that was initially identified as a mono- methyltransferase for H3K4, but also methylates many non-histone proteins such as p53 and DNMT1. SET7/9-dependent methylation has variable functional outcomes e.g. protein stabilization or crosstalk with other post-translational modifications. In this thesis, ARTD1 and the linker histone H1 have been identified as new targets for SET7/9 and the influence of SET7/9 on their cellular functions has been characterized. We found in vitro and in vivo that SET7/9 methylates ARTD1 at K508. This modification was strongly inhibited by prior poly(ADP-ribosyl)ation of ARTD1, while the methylation did not inhibit the automodification of ARTD1 nor its acetylation by p300. In cells, H2O2-induced poly(ADP-ribose) formation was decreased after SET7/9 knockdown and increased after SET7/9 overexpression. Mutation of K508 to arginine reduced the activity of ARTD1 under certain conditions, indicating that direct methylation of ARTD1 by SET7/9 is involved in the regulation of its enzymatic activity. Furthermore, we showed that SET7/9 methylates several lysine residues (K121, K129, K159, K171, K177 and K192) in the C-terminal domain of linker histone variant H1.4. Mutation of these residues, which are located at the terminal position of six KAKme motifs, did not alter the nuclear distribution of H1.4. The functional consequence of H1 methylation by SET7/9 has to be further elucidated. Finally, we observed that ARTD1-dependent histone modifications shift the substrate specificity of SET7/9 from H3 to H1. This crosstalk supports a role of poly(ADP-ribosyl)ation as an additional component of the histone code. Taken together, the identification of these two novel SET7/9 target proteins further underlines the important role of SET7/9 during the cellular stress response. Proteine verleihen Zellen ihre Struktur und Funktion und steuern alle biochemischen Prozesse. Viele Proteine werden posttranslational modifiziert, wodurch ihre Funktion und enzymatische Aktivität reguliert werden. Die ADP-Ribosylierung von Proteinen wird von ADP-Ribosyltransferasen katalysiert, welche ADP-Ribose von ihrem Coenzym NAD+ auf ihre Zielproteine übertragen. Die bekannteste ist ARTD1 (auch PARP1), ein nukleäres Enzym, welches durch DNA-Schäden aktiviert wird und Polymere aus ADP-Ribose auf sich selbst und andere Proteine überträgt. SET7/9 wurde ursprünglich als Monomethyltransferase für H3K4 entdeckt, aber methyliert auch Lysine von vielen Nicht-Histon-Proteinen wie p53 und DNMT1. Dies hat unterschiedliche Folgen für die Substrate, z. B. ihre Stabilisierung oder die Beeinflussung von anderen posttranslationalen Modifikationen. In der vorliegenden Arbeit wurden ARTD1 und das Linkerhiston H1 als neue Substrate für SET7/9 identifiziert und der Einfluss der Methylierung auf deren Funk- tionen in der Zelle untersucht. Wir fanden in vitro und in vivo, dass SET7/9 ARTD1 an K508 methyliert. Dies wurde durch vorherige Poly(ADP-Ribosyl)ierung von ARTD1 stark gehemmt, während die Methylierung selbst weder die Automodifikation von ARTD1 noch seine Acetylierung durch p300 verringerte. In Zellen führte SET7/9-Knockdown zu verringerter Synthese von Poly(ADP-Ribose) nach H2O2- Behandlung, während SET7/9-Überexpression den gegenteiligen Effekt hatte. Auch Mutation von K508 zu Arginin verringerte die Aktivität von ARTD1 unter bestimmten Bedingungen, was darauf hindeutet, dass die Methylierung durch SET7/9 die enzymatische Aktivität von ARTD1 direkt beeinflusst. Desweiteren haben wir gezeigt, dass SET7/9 mehrere Lysine (K121, K129, K159, K171, K177 and K192) im C-Terminus der Linkerhiston-Variante H1.4 methyliert. Alle sechs Lysine liegen am Ende der Konsensus-Sequenz KAKme und ihre Mutation verändert die Verteilung von H1.4 im Zellkern nicht. Die genaue Funktion dieser H1-Methylierung muss noch erforscht werden. Interessanterweise methyliert SET7/9 nach ARTD1-abhängigen Histonmodifikationen bevorzugt H1 statt H3, was die Rolle der Poly(ADP-Ribosyl)ierung als Teil des Histoncodes untermauert. Die Identifikation von zwei neuen SET7/9-Substraten in dieser Dissertation hebt die wichtige Rolle von SET7/9 in zellulären Stressreaktionen hervor