Bajusz Tamásné

Várkonyi Zoltán

Hungarian

University of Szeged

HŐMÉRSÉKLET HATÁSA A TORMAGYÖKÉR PEROXIDÁZ AKTIVITÁSÁRA ÉS FLUORESZCENCIÁJÁRA BAJUSZ TAMÁSNÉ*—VÁRKONYI ZOLTÁN** Bevezetés Az élő szervezetekben lejátszódó biokémiai reakciókat katalizáló enzimek másod-, harmad- és negyedleges szerkezete a reakciók során megváltozik. Ismeretes tény az is, hogy az enzimek aránylag enyhe hatásra (hő, sav, lúg, detergensek hozzá-adása stb.) elveszthetik eredeti natív sajátosságaikat. A denaturáció alkalmával a fehérje gyakran kicsapódik az oldatból, egyes csoportok, amelyek az eredeti mole-kulában rejtve voltak, reakcióképesekké válnak, megszűnik a protein biológiai akti-vitása [1]. A szerkezetváltozást több módszerrel vizsgálták, többek között az ab-szorpciós a fluoreszcencia jellemzőkben tapasztalható eltérések figyelemmel kíséré-sével [2, 3]. Célunk az volt, hogy kapcsolatot keressünk a peroxidáz enzim (HRP) esetében a hőmérséklet hatására létrejött enzimaktivitás változás és fluoreszcencia intenzitás-változás között. A peroxidázról régen ismert, hogy egyike a leghőellenállóbb enzimnek. A per-oxidázmaradékoknak tulajdonították a kellemetlen szag kifejlődését rosszul pasz-törizált savanyítmányokban ;[4], és KAPLAN és mts-ai [5], valamint DASTUR és mts-ai [6] a peroxidáz aktivitását használták fel a savanyú gyümölcsök, mint alma, körte és meggy megfelelő termikus kezelése kritériumaként. A peroxidázoknak igen fontos fiziológiai szerepük is van, mint ismeretes, álta-lában katalizálják bizonyos vegyületek oxidálását peroxid segítségével. A maga-sabbrendű állatoknál és az embernél a létfontosságú jódozási reakciók jó modelljéül szolgál [7, 8, 9], citokémiai módszerekkel sikerült kimutatni, hogy pajzsmirigyben a tiroxin képződése helyén peroxidázok találhatók [10], és hasonló mechanizmust írtak le tengeri algák esetében is [11]. A peroxidáz teljes szekvenciája ma még nem ismeretes. WELINDER és mts-ai [12] csak részben tárták fel az enzim aminosav sorrendjét, továbbá azt tudjuk, hogy egy fehérje és egy hem részből áll, mégpedig úgy, hogy a vas atom 6 koordinációs helye közül néggyel a pirrol gyűrűk nitrogénjeihez kötődik. A fennmaradó két kötés-sel kapcsolódik az apoproteinhez, minden jel szerint egy karboxil csoporton és egy hisztidin aminosav oldallánc imidazol gyűrűjén keresztül. A HRP fontos biológiai, fiziológiai szerepe, ipari alkalmazása indokolttá teszi tulajdonságainak, így optikai tulajdonságainak is jobb megismerését. Vizsgálatához a fluoreszcenciás módszer azért is jelentős [13], mert gyors, kényelmes, kevés anyag felhasználásával [14,15] az objektum sérülése nélkül alkalmazható. * Élelmiszeripari Gépek és Műveletek Tanszék ** JATE Biofizika Tanszék 3 33 Vizsgált anyagok és kísérleti módszerek Vizsgálatainkhoz Nutritional Biochemical Corporation (Clevland) cég liofili-zált, háromszor kristályosított tormagyökér peroxidáz készítményét használtuk. Ennek 1.10 -5 M/l kocnentrációjú neutrális trisz pufferes oldatát vizsgáltuk 5—95 °C hőmérsékleti intervallumban. A fluoreszcencia színképeket a JATE Biofizika Tanszé-kén összeállított spektrofluoriméterrel [16], túlnyomórészt a gerjesztő fényre merő-leges megfigyelés meliett temperálható küvettában vettük fel. A peroxidáz aktivitá-sát [17] alapján vizsgáltuk spektrofotometrikusan. Szubsztrát hidrogénperoxid, hid-rogén donor a guajakol volt, termék pedig a tetra guajakol. Az aktivitásváltozással járó optikai denzitásváltozást egy Optica Milano CF4DR típusú spektrofotométeren 470 nm-nél figyeltük meg. Mérési eredmények. Diszkusszió Mi a peroxidáz enzim aktivitását 10—90 °C hőmérsékleti tartományban hatá-roztuk meg. Melegítéskor az enzim aktivitása növekedett egészen 38°C-ig. Itt érte el a maximumot, amit 100%-nak vettünk. A hőmérséklet további növelésével az akti-vitás egyre csökken és 75 °C-nál gyakorlatilag megszűnik. A 90 °C-ig felmelegített, majd lehűtött oldat 75 °C-nál kezd ismét aktívvá válni és 40 °C körül éri el á maxi-mális aktivitást, amely az eredetinek mintegy 40%-a. Ez arra utal, hogy a peroxidáz a hőmérséklet hatására létrejött konformációs változás után is még jelentős biológiai aktivitással rendelkezik, amely a konformációs változás részben reverzibilis voltát igazolja. (1. ábra) Ha a melegítést csak kb. 45°C-ig végeztük, a visszahűtéskor kapott aktivitás-értékek megegyeztek a melegítéskor kapott értékekkel. 1. ábra. A peroxidáz 1 • 10 - 5 M/l koncentrációjú neutrális trisz pufferes oldatának aktivitási görbéje a hőmérséklet függvényében (— melegítés, — hűtés) 34 Az enzimaktivitásmérésekkel párhuzamosan fluoreszcencia intenzitásméréseket is végeztünk. A [18] alapján megállapítást nyert, hogy annak ellenére, hogy a peroxi-dáz molekulában tirozin és triptofán is van, ha mindkét aminosav gerjesztődik, a tirozin fluoreszcencia intenzitása meglepően sokkal nagyobb, mint a tiprofáné. A fluoreszcencia színképekben a 305 nm illetve 350 nm-es sávokat vizsgáltuk, me-lyek a tirozin illetve a triptofán fluoreszcenciájához rendelhetők. ¿ger j = 276 nm-nél a 305 nm-es tirozin csúcsot, 2g e r j=290 nm-nél a 350 nm-es maximummal rendelkező triptofán fluoreszcenciát néztük a hőmérséklet függvényében. Mérési eredményein-ket a 2. ábra mutatja. A 305 nm-es maximumértékek nagysága kb. 45 °C-ig és 55 °C felett jelentősen csökken, a 45—55 °C tartományban pedig közel változatlan. Ugyancsak a fluoresz-cencia intenzitások csökkenését tapasztaltuk 350 nm-nél is, bár itt a 45—60 °C hőmérsékleti tartományban tekinthetők a fluoreszcencia intenzitások gyakorlatilag változatlanok. Ehhez hasonló jelenséget tapasztaltak BARENBOIM és mts-ai [19] ribonukleáz esetén, amelyet a konformációs változáskor fellépő tirozil-karboxilát 2. ábra. A peroxidáz 1 • 10 - 5 M/l koncentrációjú neutrális trisz pufferes olda-tainak fluoreszcencia maximumai a fluoreszcencia színkép két fő sávjának megfelelően a hőmérséklet függvényében (O melegítéssel nyert adatok, A 95 °C-ra felmelegített és visszahűtéssel nyert adatok) 3' 35 hidrogén kötések felszakadásával értelmeznek. A görbék alapján úgy tűnik, hogy a konformációs változás már 40—45°C-nál megkezdődik és hosszabb ideig tart. Az intenzitások mérését a 90 °C-ra melegített oldat hűtésekor is elvégeztük. A hű-téskor kapott intenzitásértékek a melegítéskor kapott értékekhez hasonlóan változ-tak, de az eredeti értéknél alacsonyabbakat vettek csak fel. A 45 °C-ról történő visszahűtéskor mért intenzitásértékek megegyeztek a mele-gítéskor felvett értékekkel. Az aktivitás és fluoreszcenciaintenzitás mérései alapján megállapíthatjuk, hogy a fluoreszcenciaintenzitás — hőmérséklet görbe menetéből meg tudjuk határozni azt a hőmérsékleti intervallumot, ahol az enzim elveszti biológiai aktivitását, továbbá a hűtéskor kapott értékek reverzibilitásának mértékéből következtetni tudunk a konformációs átalakulás jellegére. Ezek az eredmények összhangban vannak azok-kal, amelyeket GABEL és mts-ai [20] kimotripszinnél, valamint PERLMANN [21] pepszi-nogén oldat esetén tapasztalt. A fluoreszencia és enzimaktivitás mérési eredmények továbbá összhangban van-nak az abszorpcióra [22], valamint az enzim tisztasági fokának a hőmérséklettől való függésére kapott eredményekkel [23]. Mindegyik módszerrel azt kaptuk, hogy a konformációs változások esetén a görbék menete megváltozott. Összefoglalás Peroxidáz-oldat esetében a párhuzamosan végzett fluoreszcencia és aktivitás-mérések azt mutatták, hogy a 45 °C-ig történő melegítés után, amikor még nem jött létre konformációs változás, hűtéskor az aktivitás és a fluoreszcencia értékek is 100%-osan helyreálltak. A konformációs átmenet után, a hűtéskor kapott értékek elté-rőek a melegítéskor kapott értékektől, de méréseink alapján megállapíthatjuk, hogy a fluoreszcencia intenzitások mérése az aktivitás mérésekkel kapcsolatban alkal-mas eszköz a konformációs átmenet hőmérsékleti intervallumának és a folyamat jellegének a meghatározásához. I R O D A L O M 1. Puskás A.: Biokémia és enzimológia. Tankönyvkiadó, Budapest, 1969. 2. Barenboim, G. M., Domanskii A. N., Turoverov K. K.: Luminescence of biopolymers and cells Plenum Press, New York—London, 1969. 3. Konev, S. V.: Fluorescence and Phosphorescence of Proteins and Nucleic Acids. Plenum Press, New York, 1967. 4. Labbie, M. D., Esselen W. B.: Food Technol. 8, 50 (1954). 5. Kaplan, A. M., Esselen W. B.: Food Technol. 5, 110. (1951). 6. Daslur, K„ Weckel K. G„ Elbe J.: Food Technol. 22, 1177 (1968). 7. Bjőrkstén, F.: Biochim. Biophys. Acta 212, 407. (1970). 8. Bjőrkstén, F.: Biochim. Biophys. Acta 212, 396. (1970). 9. Bjőrkstén, F.: Eur. J. Biochem. 5(1), 133. (1968). 10. Strum, J. M„ Karnovsky M. J.: J. Cell. Biol. 44, 655. (1970). 11. Murphy, M. J., Heocha C. O.: Biochem. J. 119, 21 (1970). 12. Wellinder, L. B., Smillie, L. B„ Schonbaum G. R.: Canad. J. Biochim JO, 44. (1972). 13. Stryer, L.: Science 162, 526. (1968). 14. Brand, L., Witholt B.: Methods Enzymol. 11, 776 (1967). 15. Laurence, D. J. R.: Methods Enzymol. 4, 174 (1957). 16. Várkonyi Z.—Kovács K.: Acta Biochim et Biophys. Acad. Sci. Hung. 7, 89 (1972). 17. Methods in Food Analysis: Ed. by M. A. Joslyn Acad. Press, New York—London, 1970. 18. Várkonyi Z.—Szalay L.: Acta Biochim. et Biophys. Acad. Sci. Hung. (1974) (Megjelenés alatt). 36 19. Баречбойм, Г. М., Соколечко В. А., Туроверов К. К: Цитология 10, 336 (1938) 20. Gabel, D., Steinberg I. Z., Katschalski E.: Biochemistry 10, 4661, (1971). 21. Perlmann, G.: Biopolymers Symposia, No 1, pp 383 (1964). 22. Várkonyi Z.—Kabók К.: Acta Biochim. et Biophys. Acad. Sci. Hung. (1974) (megjelenés alatt). 23. Bajuszné Kabók К: Egyetemi doktori disszertáció (1974). EFFECT OF TEMPERATURE ON ACTIVITY AND FLUORESCENCE OF HORSERADISH PEROXIDASE K. Bajusz and Z. Varkonyi Parallel fluorescence and activity measurements on peroxidase solutions showed that after heating to 45 °C, when there was still no conformational change, the activity and fluorescence intensity values were retained 100% on cooling. After the conformational transition the values ob-tained on cooling differed from those obtained on heating, but our results indicated that the measu-rement of the fluorescence intensities, in agreement with the enzyme-activity measurements, is a suitable means of determining the temperature interval of the conformational transition and the irreversible or reversible nature of the process. DER EINFLUSS DER TEMPERATUR AUF DIE PEROXYDASE AKTIVITÄT UND DIE FLUORESZENZ DER MERETTICHWURZEL K. Bajusz—Z. Vdrkonyi Parallel durchgeführte Fluoreszenz- und Aktivitätsmessungen in Peroxydaselösungen haben gezeigt, dass nach der Erwärmung bis zu 45 °C, wenn Konformationsänderungen noch nicht auf-petreten sind, beim Abkühlen die Aktivitätswerte und auch die Fluoreszensintensitätswerte hundert-errozentig wiederhergestellt werden. Nach dem Konformationsübergang weichen die beim Kühlen vohaltenen Werte von den bei der Erwärmung erhaltenen Werten ab, doch kann aufgrund unserer Eirliegenden Messungen festgestellt werden, dass die Messung der Fluoreszenzintensitäten in unklang mit den Enzymaktivitätsmessungen ein geeignetes Mittel zur Bestimmung der Tempera-tgrintervalls des Konformationsüberganges und des irreversiblen bzw. reversiblen Charakters des Vorganges darstellt. . ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА АКРИВИЗАЦИЮ ПЕРОКСИДАЗЫ И ФЛЮОРЕСЦЕНЦИЮ КОРНЯ ХРЕНА Т. Баюс, 3. Варкони В случае раствора пероксидазы проводимые параллельно измерения флюоресценции и активности показали, что при охлаждении после нагревания до 42°С, когда ещё не насту-пает конформационное изменение, показатели активизации и интенсивности флюоресценции также восстанавливаются на 100%. Показатели, полученные при охлаждении после конфор-мационного перехода, отличаются от полученных при нагревании, но на основании наших измерений можно установить, что измерение интенсивности флюоресценции совместно с из-мерениями активности энзима может быть использовано для определения температурного интервала конформационного перехода и обратимого или необратимого характера процесса. 37 

Hőmérséklet hatása a tormagyökér peroxidáz aktivitására és fluoreszcenciájára

http://acta.bibl.u-szeged.hu/20927/1/szef_tudkozl_004_033-037.pdf

Hőmérséklet hatása a tormagyökér peroxidáz aktivitására és fluoreszcenciájára

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

University of Szeged