Bajusz, Tamásné

Várkonyi, Zoltán

Hungarian

Bajusz Tamásné

Várkonyi Zoltán

University of Szeged

HŐMÉRSÉKLET HATÁSA A LIZOZIM FLUORESZCENCIÁJÁRA ÉS ENZIMAKTIVITÁSÁRA BAJUSZ TAMÁSNÉ DR.*—DR. VÁRKONYI ZOLTÁN** Bevezetés, irodalmi áttekintés Az élő szervezetekben végbemenő valamennyi folyamat speciális, az élőre jel-lemző fehérjekatalizátorok, enzimek hatására folyik le. így a proteinek közvetlenül szerepet játszanak minden ismert biológiai folyamatban, és ezzel a proteinek struk-túrája és funkciója közötti kapcsolat a molekuláris biológia kutatásának egy érdekes és fontos területévé vált. E terület megközelítése számos biofizikai és biokémiai mód-szerrel lehetséges. A funkció és a szerkezet kapcsolata vizsgálatának egy fontos mód-szere a fluoreszcenciás vizsgálati mód, amely dinamikus, ugyanakkor érzékeny eszközt szolgáltat a proteinek állapotában, struktúrájában, mikrokörnyezetében beálló válto-zások tanulmányozásához, és bizonyos felvilágosítást képes adni a biokémiai folya-matok lefolyásáról is [1]. A fluoreszcenciás módszer előnye más módszerekkel szem-ben továbbá az, hogy gyors, kényelmes, kevés anyag felhasználásával az objektum sérülése nélkül alkalmazható. (Pl. Perlmann [2.] 1 %-os pepszinogén oldatot használt az optikai forgatás tanulmányozásához, és mindössze 0,025 %-os oldatot a fluor-eszcencia tanulmányozására.) Az enzimek esetében a hőmérséklettől való függés ismerete és vizsgálata azért jelentős, mert az enzimek biológiai hatását, működését minden olyan fizikai jellemző befolyásolja, amely rájuk, mint fehérjemolekulákra hatással van. A hőmérséklet emelésével pedig a proteinek könnyen elveszthetik eredeti, nativ tulajdonságaikat, olyan konformációs változások jöhetnek létre, amelyek után a fehérjék már biológiai aktivitással nem rendelkeznek [3.]. Vizsgálati anyagul a lizozimet választottuk, amely megtalálható a tyúktojás fehérjében, de előfordul az élő szervezet különböző váladékaiban, pl. könny, nyál, stb. [4.] is. A glikozidázok közé tartozik, amelyekre jellemző, hogy a glikozidokban, az összetett cukrokban és a poliszaharidokban előforduló glikozidkötést hasítják fel vízfelvétel közben [5.]. A lizozim, amely ezen enzimek közül kitűnik magas hőstabili-tásával, acetilaminopoliszaharidokat hidrolizál [4, 5.]. Iparban több helyen is hasz-nált pl. az élesztőből történő enzimkinyerésnél. Minthogy az invertáz és a laktáz endo-enzimek, ezek csak-a sejtek elroncsolása (pl dörzsölés) vagy autolizise után hoz-záférhetők, sejtfeltárásra Jizozimet is használnak [5.]. A lizozim fluoreszcencia jellemzőinek hőmérséklet okozta változásával több szerző foglalkozott. Gally és Edelman [6.] eredményeivel megegyezően Joly [7.], * Élelmiszeripari Műveletek és Gépek Tanszék ** JATE Biofizika Tanszék " . 37 Turoverov és munkatársai [8.], Konev [9.] és Chen [10.] is arra a megállapításra jutottak, hogy a lizozim fluoreszcenciájának termikus kioltási görbéje 15°—55°C-ig pH 2,3 és 6,4 között majdnem lineáris, sőt [11.] függetlennek találták pH 6,04 és 8,5 között is. A fluoreszcencia intenzitás hőmérséklettel való változásának lineáris volta összhangban van azzal, hogy ebben a pH tartományban a hőmérséklet-emelke-dés nem eredményez strukturális változást [12., 13.]. Ebben a tartományban a válto-zások reverzibilisnek mutatkoztak. Célunk az volt, hogy a tanulmányozott enzim esetében együtt vizsgáljuk a fluoreszcencia spektrumot és az enzimaktivitást, és a jellemzők alapján vonjunk le következtetést a konformációs átalakulás hőmérsékleti intervallumáról, az átmenet reverzibilitásáról és meghatározzuk az átmenet termodinamikai paramétereit. Vizsgált anyagok és kísérleti módszerek Vizsgálatainkhoz Nutritional Biochemical Corporation (Cleveland) cég lizozim készítményét használtuk, amely háromszor kristályosított 6000—10000 egység/mg aktivitású. Aminosav szekvenciája és szerkezete jól ismert [14.], fluoreszcenciájára viszonylag sok irodalmi adat is a rendelkezésünkre állt, sőt fluoreszcencia jellemzőinek a változását is vizsgálták már bizonyos hőmérsékleti tartományban és pH értékek esetén [6., 11., 10., 8., 7.', 15.]. A fluoreszcencia színképeket a JATE Biofizika Tanszékén összeállított spektro-fluoriméterrel [14.], túlnyomórészt a gerjesztő fényre merőleges megfigyelés mellett temperálható küvettában vettük fel. A lizozim aktivitását spektrofotometrikusan vizsgáltuk [16.]. Szubsztrátként Micrococcus Lysodeikticus (Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey) készítményt használtunk. Az aktivitásváltozással járó optikai denzitás-változást egy Optica Milano CF4DR típusú spektrofotométeren 650 nm-nél figyel-tük meg. A mérés során az oldat melegítése folyamatosan történt. A leolvasást mindig akkor végeztük, amikor az oldat a küvettában felvette a kívánt hőmérsékletet. A 90 °C hőmérséklet elérése után az oldatot azonnal hűteni kezdtük. Mérési eredmények, diszkusszió Meghatároztuk a lizozim-oldat fluoreszcencia színképeit 10—90 °C hőmérsékleti intervallumban úgy, hogy a hőmérsékletet 5 °C-onként emeltük. Az 1X 10~5 M/l kon-centrációjú lizozim oldat (pH=8,04) emissziós színképeit (Agerj=290nm) az 1. ábra mutatja. A hőmérséklet emelése során azt tapasztaltuk, hogy kb. 50 °C-ig melegítve az oldatokat a spektrális eloszlás jelentősen nem változott. Magasabb hőmérsékleten azonban eltérés mutatkozott a spektrális eloszlásban és csekély mértékű maximum eltolódás is tapasztalható a hosszabb hullámok felé. A spektrum hosszúhullámú eltolódása Barenboim és munkatársai [17.] által a tripszinre talált eredményekhez hasonlóan arról tanúskodik, hogy a triplofán maradványok, amelyek a nativ makro-molekulánál hidrofób környezetben vannak, átmenet következtében az oldószer számára hozzáférhetővé válnak, és ez a makromolekulák szétszakadásáról tanúsko-dik. Másrészt oka lehet az is [18.]," hogyha a makromolekula rezgési energiája jelentő-sen megnő, és az intramolekuláris kötések a hőmérséklet emelése következtében meggyengülnek, a gerjesztés pillanatában létrejöhet a molekula denaturációja, vagy a molekula más nagyobb potenciális energiának megfelelő módosulatba mehet át. A spektrum enyhe kiszélesedése pedig kapcsolatban lehet a tirozin maradványok ha-tásának megnövekedésével a fluoreszcencia spektrumban [17.]. 38 Ag - 2 9 0 nm 4-40' m/l L/z.+foszfát puffer \ \ átlog \ \ &0X \ \ 90°C \ • \ • \ \ » • \ •. \ \ Aso J\ (nm) 1. ábra. 1X10"5 M/l koncentrációjú foszfát pufferes (pH 8,04) lizozim oldat relatív emissziós színképei különböző hőmérsékleteken 290 nm-es gerjesztésnél 20 10 HÓ*H/l Ltz.-r foszfól p u f f e r Ay -290 nm pH* á,OJf i O 3 O 90 70 9o t ( ° c ) 2. ábra. 1X10~6M/1 koncentrációjú foszfát pufleres (pH 8,04) lizozim oldat fluoreszcencia maximumai önkényes egységben a hőmérséklet függvényében 290 nm-es gerjesztésnél L m 15 UO5M/L Liz. + (oszlói p u f f e r 1 1 " n o m<zlagités a hübés Ay-290 nm A A * A A A A £ iO 20 30 MO SQ ¿ 6 0 ' 7 0 <90 (°C) 3. ábra. A lizozim 1X 10~5 M/l koncentrációjú pH 8,04-es foszfát pufferes oldatának fluoreszcencia maximumai a hőmérséklet függvényében (0-melegítéssel nyert adatok, A-90 °C-ra felmelegített és visszahűtéssel nyert adatok) •40 A 80—90 °C-ra felmelegített, majd lehűtött oldatok fluoreszcencia spektrumai-nak alakja hasonló volt a melegítéskor kapottakéhoz. A fluoreszcencia spektrumokat úgy is felvettük, hogy az 50°C-ra melegített oldato-kat hűtöttük le. A hűtve, illetve melegítve felvett spektrumok alakjában nincs különbség. A 290 nm-nél gerjesztett fluoreszcencia spektrumok maximumai a hőmérséklet növelésével jelentősen csökkentek (2. ábra). Ez a csökkenés kb. 40—45 °C-ig monoton itt az egyenes iránytényezője —0,9. Kb. 40—45°C-nál a görbe iránya és mere-deksége megváltozott, az iránytényező most—0,4. Melegítéskor a fluoreszcencia intenzitás jelentősen csökkent (3. ábra), míg visszahűtéskor csak csekély mértékben növekszik. Visszahűtéskor az intenzitás jóval kisebb, mint ugyanazon a hőmérsékleten melegítéskor volt. A visszahűtés és a mele-gítés közötti különbség a hő okozta irreverzibilis változásról tanúskodik. A fluoreszcencia 340 nm-nél mért intenzitása megegyezett a melegítéskor kapott értékekkel. Tehát 50°C-ig a melegítés hatására az enzimben maradandó változás nem következett be, azaz a változás reverzibilis, eltérően a magasabb hőmérsékletre történő melegítéstől. Az 50°C-ról történő visszahűtéskor kapott eredmények arról tanúskodnak, hogy ebben a hőmérsékleti intervallumban tisztán-hőmérsékleti kioltással van dolgunk. Az emisszióméréssel párhuzamosan meghatároztuk az 1X 10~5 M/l koncent-rációjú és 8,04pH-jú lizozimoldat aktivitását is %-ban, a hőmérséklet függvé-nyében (4. ábra). ábra. A lizozim 1X10"6 M/l koncentrációjú foszfát ,pufferes (pH 8,04) oldatának aktivitási görbéje a hőmérséklet függvényében (—0— melegítés, —A— hűtés) .41 Az aktivitás kb. 35 °C-nál éri el a maximumát, 10—35 °C-ig jelentős növekedést 35 °C felett pedig nagymértékű csökkenést mutat a hőmérséklet emelésekor. Az enzim -60 °C környékén már teljesen inaktívvá válik. Az oldat visszahűtésekor mért értékek .— bár csekély mértékben — 35 °C-ig szintén növekednek, majd csökkennek, de a .hűtés után kapott maximális aktivitás értéke a melegítéskor kapott maximum érték-nek csupán 5%-a. Az aktivitás és a fluoreszcencia intenzitás mérései alapján megállapíthatjuk, hogy a fluoreszcencia intenzitás — hőmérséklet görbe menetéről meg lehet határozni azt •a hőmérsékleti intervallumot, ahol az enzim elveszti biológiai aktivitását. A hűtéskor kapott értékek reverzibilitásának mértékéből pedig következtetni tudunk a konfor-mációs átalakulás jellegére. Ezek az eredmények összhangban vannak azokkal, ame-lyet Gabel és munkatársai [19.] kimotripszinnél, valamint Perlmann [2.] pepszinogén -oldat esetében tapasztaltak. Összefoglalás Párhuzamosan végzett fluoreszcencia és aktivitásmérések azt mutatták, hogy a iizozim oldat aktivitásának és fluoreszcencia intenzitásának az értéke teljesen helyre-áll, ha az oldatot 50 °C-ig történő melegítés után hűtjük. Ekkor még nem jött létre konformációs változás. Az 50—90 °C tartományban a változások irreverzibilisek. A fluoreszcencia intenzitások mérése és összevetése az aktivitás mérésekkel alkalmas eszköz a konformációs átmenet hőmérsékleti intervallumának és a folyamat jellegé-nek a tanulmányozására. IRODALOM 1. Styer, L.: Science 162, 526, (1968) 2 Perlmann, G. E. ; Biopolymers Symposia No. 1 pp 383 (1964) 3 Straub F. В.; Biokémia Medicina Könyvkiadó, Bp., 1961. 4 Rapoport, S. M.; Medizinische Biochemie, VEB Verlag Volk und Gesundheit, Berlin, 1969. 5. Dr. Tolnay P.; Ipari enzimológia. Műszaki Könyvkiadó, Bp., 1963. 6. Gally, J. A., Edelman, G. H.: Biochim. Biophys. Acta 60, 499, (1962) 7. Жоли, M.: „Физическая химия денатурации бельков," Мир, Москва, 1968. Я. Barenboim, G. М, Domanskii А. N.. Turooerov К. К.: „Luminescence of biopolymers and cells" Plenum Press, New York—London, 1969. 9. Konev, S. V.: Dok . Akad. Nauk. SSSR 116, 594, (1957) 10. Chen, R. F.: „Fluorescence: Theory, Instrumentation and Practice" M. Dekker, Inc. New York, 1967. 11. Steiner, R. F., Edelhoch G. # . ; Biochim. Biophys. Acta 66, 341, (1963) 12. Donovan, J., Laskowski M„ Jr and H. A. Scheraga: J. Am. Chem. Soc. 82, 2154, (1960) 13. Tanford, C., Wagner M.; J. Am. Chem. Soc. 76, 3331, (1954) 14. Várkonyi Z.—Kovács К.; Acta Biochim. et Biophys Acad. Sei. Hung. 7, (1972) 115. Konev, S. V.: Fluorescence and Phosphorescence of Proteins and Nucleic Acids. Plenum Press, New York, 1967. .16. Schugar, D. ; Biochim. Biophys. Acta 8, 302, (1952) 17. Баренбойм, Г. M., Соколенке, В. А., Туреверов, К. К.: Цитология 10, 636, (1968) •18. Ljovsin, V. L.; Folyékonyés szilárd anyagok fotolumineszcenciája. Akadémiai Kiadó, Bp., 1956. 39.' Gabelí D.. Steinberg I. Z.. Katschalki E.: Biochemistry 10, 4661, (1971) 42 EFFECT OF TEMPERATURE ON THE FLUORESCE NCE A N D ENZYMATIC ACTIVITY OF LYSOZYME K. Bajusz and Z. Varkonyi Parallel measurements of fluorescence and activity showed that the values of the activity and the fluorescence intensity of a lysozyme solution were fully restored if the solution was cooled after heating to 50 °C; no conformational change had as yet taken place. In the range 50—90 °C the changes were irreversible. Measurement of the fluorescence intensities and their comparison with activity measurements is a suitable means of studying the temperature interval of the conformation transition and the nature of the process. DER EINFLUSS DER TEMPERATUR AUF DIE FLUORESZENZ U N D ENZYMAKTIVITÄT DES LYSOZYM K. Bajusz—Z. Värkonyi Parallel angestellte Fluorsezenz- und Aktivitätsmessungen haben gezeigt, dass die Aktivität und Fluoreszenzintensitätswerte der Lysozymlösung vollkommen wiederhergestellt werden, wenn die Lösung nach Erwärmen auf 50 °C gekühlt wird. Zu dieser Zeit ist noch keine Konformations-änderung eingetreten. Im Temperaturbereich von 50—90 °C sind die Veränderungen irreversibel. Die Messung der Fluoreszenzintensitäten und ihr Vergleich mit den Aktivitätsmessungen stellen ein geeignetes Mittel zum Studium des Temperaturintervalles des Konformationsüberganges und des Charakters des Vorganges dar. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА ФЛУОРЕСЦЕНЦИЮ ЛИЗОЗИМА И АКТИВНОСТЬ ЭНЗИМА Т. Байус—3.—Варкони Проводимые параллельно измерения флуоресценции и активности свидёт'ельствуют о том, что показатель активности раствора лизозима и интенсивности флуоресценции пол-ностью восстанавливаются, если после подогревания до 50 °С раствор лизозима подвер-гался охлаждению, так как при этом ещё не произошло изменение конформации. В области температур от 50 до 90 °С изменения уже необратимы. Измерения интенсивности флуорес-ценции и сопоставление их с измерениями активности является одним из целесообразных путей исследования температурного интервала и характера процесса конформационного обращения (перехода). 43 

Hőmérséklet hatása a lizozim fluoreszcenciájára és enzimaktivitására

http://acta.bibl.u-szeged.hu/20947/1/szef_tudkozl_005_037-043.pdf

Hőmérséklet hatása a lizozim fluoreszcenciájára és enzimaktivitására

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

University of Szeged