Polyglutamine-mediated and heavy metal-induced transcription from yeast to humans

Abstract

During my PhD thesis I was following two major projects, namely, the effect of polyglutamine tracts on the activity of a specific transcription factor, and on regulation of heavy metal homeostasis and detoxification. Project I: Many proteins, especially regulatory proteins of gene expression, contain homopolymeric repeats of single amino acids, such as glutamine, asparagine, serine, glycine, proline and alanine. Especially polyamino acid tracts that are encoded by repeats of a same codon are genetically unstable, due to polymerase slippage and out- of-register recombination, and thus subject to expansion and shrinkage. No less than 18 diseases are known to date to be caused by polyglutamine or polyalanine expansions. Since polyamino acid tracts are found from yeast to humans and even in bacteria the question arose whether they might also exert some positive effects, i.e., whether they might confer some kind of selective advantage. In our lab it had been shown before that a polyglutamine tract in a synthetic transcription factor can contribute to transcriptional activation, and it was postulated that expansion and shrinkage are useful to reversibly alter the activity of transcription factors in short- term evolution [Gerber HP et al, Science 1994, 263:808-11]. I have confirmed and extended these results by showing a clear, positive correlation between the length of a polyglutamine stretch and the transcriptional activation by the factor Gal4DBD- polyQ-VP16AD (Gal4DBD = DNA binding domain of the yeast Gal4 transcription factor, polyQ = polyglutamine stretch, VP16AD = activation domain of the viral protein VP16) in widely divergent species, namely, human cells, transgenic flies, and baker’s yeast. I also wished to test the hypothesis that homopolymeric codons are genetically less stable than a mixture of codons for a homopolymeric amino acid tract, but the number of generations was probably too small to observe differences. Project II. It is now widely recognized that a major challenge for any cell is to keep the right balance of essential trace metals and at the same time minimize the effect of non-essential ones such as cadmium, mercury, lead and silver. This is achieved by a variety of mechanisms, notably metal-specific import or export, binding to specific chaperones, storage, and detoxification by scavenging and export. Even essential metals such as copper and iron can have adverse effects if in excess, by interfering with metabolic functions via misincorporation into proteins, or by generation of reactive oxygen species due to redox cycling. Metallothioneins are small, cysteine-rich proteins which avidly bind a number of essential and non-essential heavy metals. Here I characterize metallothionein E (MtnE), the fifth and apparently ultimate member of the Drosophila metallothionein family. It is strongly expressed in the intestinal tract, notably in the so-called copper cells and in the iron cells of the midgut. I was also involved in the characterization of two related, small Drosophila proteins named Dumpy-30L1 and Dumpy-30L2. Dumpy-30L1 binds to, and thereby downregulates, the activity of MTF-1 (metal-responsive transcription factor-1). Accordingly, overexpression of Dumpy-30L1 rendered flies more sensitive to an excess of dietary copper or zinc. Targeted disruption of the gene for Dumpy-30L2 revealed a different phenotype in that male fertility was compromised. Furthermore, I was involved in a study led by D. Steiger on the characterization of Ctr1C, a copper importer which is strongly expressed in male gonads and contributes, together with the importer Ctr1B, to male fertility [Steiger et al, JBC 2010, 285(22):17089-97]. All these studies have led to a deeper understanding of various aspects of cellular metal homeostasis. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit zwei Themengebieten: Im ersten Teil wird die Auswirkung von Polyglutamin-Einheiten auf die Aktivität eines Transkriptions-faktors untersucht. Während im zweiten Teil verschiedene Aspekte der Regulation von Schwermetallhomöostase und -entgiftung behandelt werden. Projekt I: Viele Proteine, vor allem Regulatorproteine der Genexpression, enthalten Bereiche von Polyaminosäuren zum Beispiel von Glutamin, Asparagin, Serin, Glycin, Prolin und Alanin. Polyaminosäuren, welche durch Wiederholungen des selben Codons kodiert werden, sind genetisch instabil. Sich wiederholende Codons können ein Verrutschen der DNA-Polymerase oder eine fehlerhafte genetische Rekombination verursachen und führen somit zu einer Verlängerung oder einer Verkürzung der DNA-Sequenz und folglich auch der Polyaminosäure-Einheiten. Bislang sind 18 Krankheiten bekannt, welche durch eine ausufernde Verlängerung eines Polyglutamin- oder Polyalanin-Abschnitts verursacht werden. Da Polyaminosäuren von der Hefe bis zum Menschen vorkommen, stellte sich die Frage, ob Transkriptionsfaktoren, welche einen solchen Polyaminosäuren-Abschnitt enthalten, einen selektiven Vorteil haben. In unserem Labor wurde gezeigt, das ein Polyglutamin-Abschnitt in einem synthetischen Transkriptionsfaktor zur transkriptionellen Aktivität beiträgt. Es wurde vorgeschlagen, dass eine im Prinzip umkehrbare Veränderung der Polyglutaminlänge es möglich macht, die Aktivität eines Transkriptionsfaktors im Sinne einer Kurzzeit-Evolution zu modulieren [Gerber HP et al., Science 1994, 263:808-11]. In der vorliegenden Arbeit konnte ich diese Ergebnisse bestätigen und durch weitere Experimente vertiefen. In den evolutionär weit auseinander stehenden Arten, Mensch (Zellkultur), Fliege und Bäckerhefe, wird eine eindeutige positive Korrelation zwischen der Länge einer Polyglutamin-Einheit und der Aktivität des synthetischen Transkriptionsfaktors Gal4DBD-polyQ-VP16AD gezeigt (Gal4DBD: DNA-Bindedomaine des Transkriptionsfaktors Gal4 der Bäckerhefe, polyQ: Polyglutamin-Abschnitt, VP16AD: Aktivierungsdomäne des viralen Aktivatorproteins VP16). Unter anderem wollte ich auch die Hypothese testen, dass sich selbst wiederholende Codons im Vergleich zu einer Mischung von Codons, welche einen Polyaminosäure-Abschnitt kodieren, genetisch weniger stabil sind. Die Anzahl der Generationen reichte jedoch vermutlich nicht aus, um ein aussagekräftiges Ergebnis zu erhalten. Projekt II: Jede Zelle steht vor der Herausforderung die Konzentration an essentiellen Spurenelementen auf einem bestimmten Niveau zu halten und gleichzeitig eine Schädigung durch nicht-essentielle, giftige Metalle, wie Cadmium, Quecksilber, Blei und Silber, zu vermeiden. Eine Vielzahl von zellulären Mechanismen spielen hierbei eine Rolle: metall-spezifischer zellulärer Import, Bindung an spezifische intrazelluläre Bindeproteine („Chaperone“), Speicherung und Entgiftung durch Bindung und Export. In zu hohen Konzentrationen können sogar essentielle Metalle wie Kupfer und Eisen die Zelle schädigen, indem sie unspezifisch an Proteine binden und deren Funktion beeinträchtigen und/oder Sauerstoffradikale erzeugen. Metallothioneine sind kleine, cysteinreiche Proteine, welche eine Vielzahl von Metallen mit hoher Affinität binden. In dieser Arbeit charakterisiere ich MtnE, das letzte von fünf Mitgliedern der Metallothionein-Familie in Drosophila. Dieses Protein wird im Magen/Darm-Trakt stark exprimiert, und ist vor allem in den sogenannten Kupfer- und Eisenzellen des Mitteldarmes angereichert. Zudem war ich bei einer Studie beteiligt, in der zwei nah verwandte, kleine Proteine, Dumpy-30L1 und Dumpy-30L2, in Drosophila untersucht wurden. Es wurde gezeigt, dass Dumpy-30L1 an den Transkriptionsfaktor MTF-1 („metal-responsive transcription factor-1“) bindet und dadurch dessen Aktivität hemmt. Dementsprechend erhöht die Überexpression von Dumpy-30L1 in Drosophila die Sensitivität der Fliegen gegenüber Kupfer und Zink. Im Gegensatz dazu führte die Entfernung des Gens für Dumpy30L2, zu einer verminderten Fertilität männlicher Fliegen. In einer anderen Studie habe ich in Zusammenarbeit mit Dr. Dominik Steiger das Kupferimportprotein Ctr1C untersucht. Dieses Protein wird vor allem in den Keimdrüsen männlicher Fliegen exprimiert und ist neben Ctr1B, einem homologen Kupferimportprotein, für die Fertilität der Männchen notwendig [Steiger et al., JBC 2010, 285(22):17089-97]. Die Studien zu diesem Projekt haben zu einem besseren Verständnis der zellulären Metallhomöostase beigetragen