Dzeikala, A.

Nowak, A.

Sykuła, A.

Łodyga-Chruścińska, E.

Repository of Polessky State University (Репозиторий Полесского государственного университета)

92  Максимальная частота встречаемости перенесенного ОНМК наблюдается у женщин в возрасте от 60 лет и старше, что обусловлено привыканием к гипотензивным препаратам и несвоевременной корректировкой схемы лечения. Основную долю пациентов, страдающих АГ, составляют лица от 40 лет и старше, поэтому ве-роятность заболевания с возрастом увеличивается. По результатам теоретического и практического исследования можно отметить, что в группу риска по развитию АГ следует отнести следующие категории лиц: - мужчин в возрасте старше 40 лет; - людей с избыточной массой тела; - ведущих малоактивный образ жизни; - лиц, имеющих вредные привычки: курение и употребление алкоголя; - имеющих атеросклероз, сахарный диабет, ишемическую болезнь сердца. С учетом вышеизложенного можно отметить, что АГ страдают около 40 % взрослого населения Беларуси. Хотя за последние годы количество пациентов, которые знают о своем заболевании и принимают гипотензивные препараты, увеличилось, но стабильной нормализации артериального давления (АД) добиваются только 21,5 % пациентов. Как известно, повышенное АД приводит к поражению сердца, периферических сосудов и сосудов головного мозга, почек. Пациенты при АГ погибают от органных осложнений заболевания: инсультов, инфарктов, сердечной и почечной недостаточности. АГ может привести к развитию деменции. Особенно важно, чтобы гипотензивная терапия позволяла достигать и стабильно поддерживать артериальное давление на целевом уровне. Это позволяет добиться максимального снижения сер-дечно-сосудистого риска и защиты органов-мишеней. Лекарственная терапия обязательно должна сочетаться с немедикаментозными мерами, направленными на модификацию факторов риска: снижением массы тела, отказом от курения, ограничением употребления в пищу поваренной соли, алкоголя, повышением содержания в пище калия и увеличением физических нагрузок. Причем подобные рекомендации должны даваться как с целью профилактики АГ у пациентов с факторами риска и коррекции АД у пациентов низкого и среднего риска, так и на фоне лекарственной терапии для увеличения ее эффективности.  Список использованных источников 1. Бубнова, М.Г. Современные принципы профилактики и лечения артериальной гипертонии. Анализ основных положений международных рекомендаций / М.Г. Бубнова // Справочник поликлинического врача. – 2005. – № 4. – С. 8-14. 2. Бурмистрова, Е.К. Развитие артериальной гипертензии у лиц, подверженных влиянию хронического стресса: автореф. дис. ... канд. мед. наук / Е.К. Бурмистрова. – Самара, 2009. – 16 с. 3. Кузнецова, Н.В. Клиническая фармакология: учебник / Н.В. Кузнецова. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2013. – 272 с.   УДК 577  ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА DNA-COMET ASSAY ДЛЯ ОЦЕНКИ УРОВНЯ  ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК РАКОВЫХ КЛЕТОК ЛИНИИ HeLa,  ВЫЗВАННЫХ ОСНОВАНИЯМИ ШИФФА  И ИХ КОМПЛЕКСАМИ С ИОНАМИ МЕДИ(II)  DZEIKALA Aliaksandr, MSc. (in Biology) PhD student,  NOWAK Adriana, PhD (in Biology), Adiunct;  SYKUŁA Anna, PhD (in Chemistry), Adiunct;  ŁODYGA-CHRUŚCIŃSKA Elżbieta, Prof. (in Chemistry) Poland, Lodz University of Technology  Введение. Попытки, направленные на изучение ядерных структур клетки и количественное определение нитевых повреждений ДНК в одиночных клетках организмов, были предприняты еще в 1978г. такими учеными, как Cook и Brazell [1]. Однако лишь в 1984г. шведские исследовате-ли Ostling и Johanson разработали новый метод определения повреждений ДНК [2]. 93  Именно они, в публикации 1984г., заметили, что изображения фрагментов ДНК, мигрировав-ших в электрическом поле, напоминали астрономические кометы. «Кометы», полученные учены-ми из Швеции, обладали главными характеристиками космических комет: они имели «голову» и «хвост» [3]. Отсюда и пошло название – метод ДНК-комет (DNA-comet assay). «Голова» кометы состоит из клубка ДНК, а «хвост» из мигрировавшей ДНК [1], для визуализа-ции генетического материала препараты окрашивают флуоресцентными красителями (бромистый этидий, акридиновый оранжевый и др.), а затем визуализируют с помощью флуоресцентного мик-роскопа [3]. Впоследствии метод неоднократно модифицировался и совершенствовался с целью его упрощения и повышения чувствительности выявления повреждений клеточной ДНК. Надо четко представлять, что «комета» образуется не из клетки живого организма, а именно из ее ДНК. Помещенная в агарозный слой суспензия клеток образует полости, которые в процессе лизиса занимает ДНК этих клеток. Все дальнейшие манипуляции в методе ДНК-комет осуществ-ляются именно с ДНК. Материалы и методы исследования. В настоящей работе представлены результаты оценки уровня повреждений ДНК раковых клеток линии HeLa, вызванных основаниями Шиффа на основе гесперетина (hesperetin) и их комплексов с ионами меди(II), структуры исследуемых соединений представлены на рисунке 1. Гесперетиновые основания Шиффа синтезированы в результате реак-ции флавоноида с N-бензоил гидразином (N-benzoyl hydrazine) – HHSB и изониазидом (isoniazid) – HIN. Получение основания Шиффа являлись основой для синтеза их комплексов с ионами ме-ди(II). Структура и физико-химические свойства лигандов и их комплексов охарактеризованы с помощью, спектроскопии ядерного магнитного резонанса ядер 1H и 13C, инфракрасной спектро-скопии, абсорбционной спектрофотометрии, элементного анализа (Lodyga-Chruscinska et al. 2015). Культура клеток. Клеточная линия аденокарциномы шейки матки человека (HeLa) использо-валась в качестве модельной клеточной линии в исследовании. Клетки культивировали в течение 7 дней при 370С в атмосфере 5% СО2 с использованием модифицированной Дульбекко среды (DEME, Sigma), дополненной 10% фетальной сывороткой теленка (FBS, Gibco), 4 mМ GlutaMAXTM (Gibco), 25 mМ HEPES (Sigma), 100 µg/mL стрептомицина и 100 IU/mL пеницилли-на (Sigma). Метод ДНК-комет (comet assay). Конечную концентрацию клеток HeLa в каждом образце до-водили до 105 клеток/mL. 900 µL клеток инкубировали с 100 µL каждого соединения при 370С в течение 1 часа. Все концентрации тестируемых соединений были свежеприготовлены непосред-ственно перед добавлением в культуру клеток линии HeLa. Конечные концентрации соединений: 1, 10 и 50 µM.  OHOOH OOHOCH3OHOOH NOHOCH3HNOHHSBOHOOH NOHOCH3HNONHINHesperetinCuHHSBOHOO NOHOCH3NHOCuH3CCOOCuHINOHOO NOHOCH3NHONCuH3CCOO  Рисунок – Химическая структура гесперетиновых производных оснований Шиффа HHSB, HIN и комплексов меди (II) CuHHSB, CuHIN.  Анализ комет проводили в щелочных условиях (рН>13) в соответствии с  процедурой Singh et al. 1988 с некоторыми изменениями (Klaude et al. 1996; Błasiak & Kowalik 2000). После инкуба-ции клетки центрифугировали (182g, 15 мин), декантировали, суспендировали в 0,75% LMP (низкая температура плавления агарозы), по истечению 10 мин наносили на слайды, предвари-тельно покрытые 0,5% NMP (нормальная температура плавления агарозы) и лизировали. После часовой обработки в лизирующем буфере [2,5 М NaCl, 1% Triton X-100, 0,1 М EDTA и 10 mМ Tris 94  (рН 10)] при 40С, препараты помещены в электрофорезную камеру на 20 мин при 40С в щелочной буфер [300 µМ NaOH и 1 µМ EDTA], а затем подвергнуты электрофорезу в течение 20 мин при напряженности электрического поля 0,73 В/см (300 мА) при той же температуре. После электро-фореза проводили нейтрализацию дистиллированной водой. После чего слайды слегка подсуши-вали и фиксировали. Для окраски ДНК использовали 2,5 µg/mL пропидиевый йодид (propidium iodide). Визуализа-цию ДНК-комет проводили с помощью флюоресцентного микроскопа с использованием объекти-ва × 200 (Nikon, Япония) и видеосистемы на основе цифровой камеры с программой анализа изоб-ражений – Lucia-Comet v. 7.0 (Laboratory Imaging, Прага, Чешская Республика). В качестве крите-рия поврежденности ДНК использовали % ДНК в хвосте комет. Результаты и обсуждение. генотоксическую активность лигандов HHSB и HIN, а также ком-плексов CuHHSB и CuHIN тестировали на опухолевых клетоках линии HeLa в трех концентраци-ях: 1, 10 и 50 µМ, результаты исследований представлены в таблице. Положительным контролем в данной серии экспериментов были клетки линии HeLa, инкубировавшиеся в течение 1 часа в при-сутствии цисплатины (cisplatinum) при 370С.  Таблица – Повреждение ДНК (± S.E.M.) в клетках линии HeLa после электрофорезы для иссле-дуемых соединений, выраженных в % ДНК в хвосте кометы. Количество клеток, проанализиро-ванных в каждом повторении, составляло не менее 50 ДНК-комет для каждого соединения.  Соединение Концентрации соединений 50 μM 10 μM 1 μM % ДНК в хвосте кометы (± S.E.M.) Cisplatin 66.1 ± 4.2 43.1 ± 5.1 21.9 ± 4.4 HHSB 68.8 ± 4.1 43.8 ± 2.4 28.8 ± 4.1 CuHHSB 47.8 ± 3.8 27.1 ± 3.5 30.3 ± 4.6 HIN 46.7 ± 3.3 35.5 ± 4.7 28.9 ± 3.5 CuHIN 33.2 ± 4.0 17.4 ± 2.9 15.6 ± 1.8  Из таблицы следует, что генотоксичность цисплатина и HHSB была самой высокой в сравне-нии с исследуемыми соединениями: от 21,9%±4,4% до 66,1%±4,2% и от 28,8%±4,1% до 68,8±4,1% для цисплатина и HHSB, соответственно. Как HHSB, так и его комплекс с медью показали гено-токсическую активность, однако лиганд HHSB показал большую генотоксическую активность, чем его комплекс CuHHSB, что было лучше продемонстрировано в случае более высоких концен-траций – 10 и 50 µМ. В случае 1 µМ различия не были заметны, 28,8±4,1% и 30,3%±4,6% для HHSB и CuHHSB, соответственно. Более низкую генотоксичность к клеткам линии HeLa, прояв-лял комплекс CuHIN, чем HIN. % повреждения ДНК в хвосте кометы, вызванный при концентра-ции 1 µМ CuHIN, был почти в два раза ниже (15,6±1,8%), чем в присутствии HIN (28,9±3,5%). Полученные данные свидетельствуют о том, что гесперетиновые производные оснований Шиффа и комплексов с ионами металлов являются перспективным классом органических соеди-нений, которые могут использоваться в качестве потенциальных лекарственных препаратов.  Список использованных источников 1. Cook, P. R. Characterization of nuclear structures containing superhelical DNA / P. R Cook., I. A. Brazell // J. Cell Sci. – 1976. – V. 22. – P. 303-324. 2. Ostling, O. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells / O. Ostling, K. J. Johanson // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1984. – V. 123. – P. 291-298. 3. Liao, W. The comet assay: A sensitive method for detecting DNA damage in individual cells / W. Liao, M. A. McNutt, W.-G. Zhu // Methods. – 2009. – V. 48. –P. 46-53.     

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА DNA-COMET ASSAY ДЛЯ ОЦЕНКИ УРОВНЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК РАКОВЫХ КЛЕТОК ЛИНИИ HeLa, ВЫЗВАННЫХ ОСНОВАНИЯМИ ШИФФА И ИХ КОМПЛЕКСАМИ С ИОНАМИ МЕДИ (II)

https://rep.polessu.by/bitstream/123456789/13117/1/DZEIKALA_PRIMENENIE_METODA.pdf

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА DNA-COMET ASSAY ДЛЯ ОЦЕНКИ УРОВНЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК РАКОВЫХ КЛЕТОК ЛИНИИ HeLa, ВЫЗВАННЫХ ОСНОВАНИЯМИ ШИФФА И ИХ КОМПЛЕКСАМИ С ИОНАМИ МЕДИ (II)

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Repository of Polessky State University (Репозиторий Полесского государственного университета)