Involvement of the AAA ATPase p97/VCP in DNA metabolism

Abstract

Cell cycle checkpoints are essential in eukaryotic cells to maintain the integrity of the genome despite constant exposure to endogenous and exogenous stressors attacking the DNA molecule. The aim of this study was to characterize the influence of the AAA ATPase p97/VCP on the functional efficiency of the G2/M cell cycle checkpoint. Since the specificity of p97/VCP is given by interaction with distinct adaptors, the Npl4 subunit of the heterodimeric main adaptor Ufd1/Npl4 was also part of the project. Additionally, smc5 and mms21 were investigated in this context as they are supposed to be potential substrates of p97/VCP. For this purpose, the proteins of choice were down regulated in U2OS cells by using siRNA. Mitotic indices of control cells and cells exposed to ionizing radiation were determined to monitor the activity of the checkpoint. This was performed in cells randomly distributed throughout the cell cycle as well as in synchronized cells. The results indicated that the G2/M checkpoint is neither significantly affected by p97/VCP nor by Npl4, smc5 or mms21. However, these results gave reason to investigate the role of p97/VCP, Npl4 and mms21 in DNA replication. Surprisingly, FACS cell cycle analysis then revealed a delayed onset of the S phase in cells depleted for p97/VCP and Npl4. Kontrollpunkte im Zellzyklus eukaryotischer Zellen sind unentbehrlich um die Integrität des Genoms, trotz fortwährenden Attacken endogener und exogener Stressoren auf die DNA, sicher zu stellen. Das Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der AAA ATPase p97/VCP auf die Funktionstüchtigkeit des G2/M Kontrollpunktes zu charakterisieren. Da die Spezifität von p97/VCP auf der Interaktion mit bestimmten Adaptoren basiert, war Npl4, eine Untereinheit des heterodimeren Hauptadaptors Ufd1/Npl4, ebenfalls Teil des Projektes. Zusätzlich wurde der Einfluss von smc5 und mms21, zwei potentielle Substrate von p97/VCP, genauer untersucht. Zu diesem Zweck wurden U2OS Zellen mit siRNA behandelt, um das gewünschte Protein vorübergehend auszuschalten. Zur darauf folgenden Überwachung der Aktivität des Kontrollpunktes wurde der mitotische Index bestimmt. Dies wurde sowohl in Kontrollzellen durchgeführt, wie auch in Zellen, welche mit 3 Gy respektive 10 Gy bestrahlt wurden. Die erhaltenen Resultate zeigten, dass in unsynchronisierten, wie auch in synchronisierten Zellen der G2/M Kontrollpunkt durch p97/VCP, Npl4, smc5 und mms21 nicht wesentlich beeinflusst wird. Jedoch haben dieselben Resultate Anlass dazu gegeben, p97/VCP, Npl4 und mms21 im Zusammenhang mit der DNA Replikation zu untersuchen. Wenn Zellen mit siRNA gegen p97/VCP und Npl4 behandelt wurden, zeigte die Zellzyklusanalyse mittels FACS einen verzögerten Eintritt in die S Phase