Mechanism of DNA damage-induced MDC1 dimerization

Abstract

Every cell needs to ensure the maintenance and faithful propagation of genetic information in order to prevent the development of life-threatening diseases such as cancer. However, cells are constantly exposed to various types of genotoxic agents e.g. free oxygen radicals or UV radiation. To counteract these threats, cells have developed specialized mechanisms to detect and repair DNA damage, and to initiate signaling cascades that delay or arrest cell cycle progression, induce certain transcriptional programs or trigger apoptosis. This complex signaling network is collectively denoted as the DNA damage response (DDR). Double strand breaks (DSBs) are one of the most hazardous forms of DNA damage because they can cause chromosomal instability or cell death if not repaired correctly. This type of DNA lesion can arise from the exposure to ionizing radiation or radiomimetic drugs, both frequently used in cancer treatment. DSBs lead to the activation of the ATM kinase and to the phosphorylation of the histone variant H2AX. Phosphorylated H2AX (γH2AX) is directly recognized by mediator of DNA damage checkpoint protein 1 (MDC1), a large mediator/adaptor protein that regulates the accumulation of DDR factors in chromatin regions flanking DSBs. MDC1 contains a forkhead associated (FHA) domain at its N-terminus. Even though it is known that FHA domains act as phosphopeptide recognition motifs, the function of the MDC1 FHA domain has remained enigmatic. In this study, we identified a novel phosphorylation-specific binding partner of the MDC1 FHA domain, namely MDC1 itself. We show that ATM phosphorylates MDC1 at the conserved N-terminal Thr4 residue in a DNA damage-dependent manner and that this induces the interaction with the FHA domain of other MDC1 molecules. Biochemical, biophysical and X-ray structural analysis revealed that the presence of a Thr4-phosphopeptide stabilizes the formation of a tight FHA dimer in a head-to-tail-oriented manner. We furthermore demonstrate that the isolated FHA domain is capable of localizing to sites of DNA damage in a phosphorylation-induced and dimerization-dependent manner. The elucidation of this mechanism contributes to our understanding of how MDC1 functions in the mammalian DDR and supports the notion that dimerization/oligomerization is a common theme of DDR mediator proteins. ZUSAMMENFASSUNG Der Erhalt und die getreue Weitergabe der genetischen Information ist wichtig für jede Zelle, um der Entwicklung von Krankheiten wie Krebs vorzubeugen. Zellen sind jedoch ständig verschiedenen Substanzen ausgesetzt, welche die DNA beschädigen (z.B. freie Sauerstoffradikale und UV-Strahlung). Um diese Gefahren abzuwenden, besitzen Zellen spezialisierte Mechanismen zur Erkennung und Reparatur von DNA Schäden sowie zur Aktivierung von Signalkaskaden, die das Fortschreiten des Zellzyklus hemmen, bestimmte Transkriptionsprogramme einleiten oder programmierten Zelltod (Apoptose) auslösen. Doppelstrangbrüche (DSBs) stellen dabei eine der gefährlichsten Formen von DNA Schäden dar, da sie bei nicht ausreichender Reparatur chromosomale Instabilität oder Zelltod zu verursachen vermögen. DSBs können durch die Einwirkung ionisierender Strahlung oder ähnlich wirkender Zytostatika, die beide häufig in der Krebstherapie ihre Anwendung finden, entstehen. DSBs führen zur Aktivierung der ATM-Kinase und Phosphorylierung der Histon-Variante H2AX. Phosphoryliertes H2AX wird direkt von MDC1, einem grossen Adapter-Protein, gebunden, das die Ansammlung von weiteren Proteinen in den Doppelstrangbruch umgebenden Chromatinregionen reguliert. MDC1 besitzt eine N-terminale FHA Domäne. Obwohl bekannt ist, dass FHA Domänen als Phosphopeptid-Erkennungsmotive fungieren, konnte die Funktion der MDC1 FHA Domäne bisher noch nicht entschlüsselt werden. In dieser Arbeit haben wir MDC1 selbst als einen neuen phosphospezifischen Interaktionspartner der MDC1 FHA Domäne identifiziert. Wir zeigen, dass MDC1 an der konservierten Aminosäure Thr4 infolge von DNA Schäden von der Kinase ATM phosphoryliert wird und dass dies für die Interaktion mit der FHA Domäne eines anderen MDC1 Moleküls verantwortlich ist. Biochemische, biophysikalische und Röntgenstruktur-Analysen legen offen, dass das T4-Phosphopeptid die Ausbildung eines FHA-Dimers in umgekehrter Orientierung stabilisiert. Des Weiteren kann die isolierte FHA Domäne an DNA geschädigte Regionen in Abhängigkeit vom Phosphorylierungs- und Dimerisierungsstatus binden. Die Aufklärung dieses Mechanismus trägt zu unserem Verständnis der Funktion von MDC1 in der Antwort auf DNA Schäden in Säugetierzellen bei und unterstützt die Auffassung von Dimerisierung (Oligomerisierung) als allgemeines Leitmotiv in Adapterproteinen.