Involvement of the mitotic kinase Aurora A in DNA damage response

Abstract

Die Hauptaufgabe der Zellteilung ist die korrekte und komplette Verdoppelung des Genoms und die folgende gleichmässige Aufteilung der Chromosomen auf die beiden Tochterzellen. Dieser Prozess wird durch eine Familie von Cyclin-abhängigen Kinasen dirigiert. Jede Kinase verbindet sich mit einer eigenen Klasse von Cyclinen, welche benötigt werden, um die verschiedenen Stadien des Zellzyklus zu durchlaufen. In höheren Eukaryoten sind der Übergang von der G2- zur M-Phase und der Abschluss der Mitose abhängig von der Aktivität eines Komplexes aus Cylin B und Cdk1. Die Aktivität von Cdk1 ist sehr straff reguliert durch Phoshorylierung und Dephosphorylierung. Die volle Aktivierung von Cyclin B/Cdk1 leitet die Mitose ein. Aktuelle Studien haben das Wissen über die Zellteilung erweitert und aufgezeigt, dass neben Cdk1 auch weitere Proteinkinasen wichtige Funktionen haben. Die Centrosomen-Reifung und die Aufteilung der Chromosomen erfordert die Beteiligung von Polo-ählichen Kinasen. Die Aufteilung der Chromosomen scheint dahingegen von Nek2 reguliert zu sein. Eine weitere wichtige Rolle in der Aufteilung der Chromosomen, der Orientierung der Chromosomen und der Cytokinese ist für Mitglieder der Aurora Familie postuliert worden. Die genomische Stabilität wird nicht nur durch den normalen Metabolismus, sondern auch durch verschiedenste Chemikalien und Strahlung ständig gefährdet. Um die korrekte Zellteilung auch in solchen Fällen zu gewährleisten, bremsen Zellzyklus Kontrollpunkte den Zellzyklus ab oder stoppen ihn ganz. Dadurch wird eine Reparatur des Schadens möglich. Falls das Ausmass des Schadens zu gross ist, wird die Apoptose eingeleitet. Der G2-Kontrollpunkt verhindert, dass Zellen die Mitose beginnen, falls DNS Schäden vorhanden sind. Diese Schäden können während der G2-, oder früher in der S- oder sogar in der G1-Phase entstanden sein, falls die Schäden dann nicht repariert worden sind. Phosphatasen der Cdc25-Familie, welche normalerweise Cdk1 an der G2/M-Grenze aktivieren, werden in solchen Fällen inhibiert und degradiert. Ausserdem vermitteln ATM/ATR und Chk1/Chk2 ein Signal, welches zu einer Sequestrierung des Cyclin B/Cdk1 Komplexes in verschiedenen subzellulären Kompartimente führt. Kürzlich wurde gezeigt, dass Kinasen, wie Plk1, Nek2 und Aurora B, welche in die normale Spindel Formation involviert sind, auch eine wichtige Rolle in der Zellantwort auf DNA Schäden spielen. In dieser Dissertation wurde Etoposid, ein Topoisomerase II Inhibitor, benutzt, um Doppelstrangbrüche zu erzeugen, um die Rolle von Aurora A in der DNS-Schadensantwort zu untersuchen. Wir haben herausgefunden, dass die Aktivität von Aurora A durch die Zellantwort auf Doppelstrangbrüche in der G2/M-Phase reguliert wird (Krystyniak A. et al, 2006). Nach Behandlung mit Etoposid war die Kinaseaktivität des Enzyms inhibiert und sein Proteinlevel stieg an. Die Frage war, ob Aurora A abhängig ist von Cdk1 oder umgekehrt. Wir haben herausgefunden, dass die Inhibition von Aurora A und Cdk1 unabhängig voneinander auftritt. Dass die Deaktivierung von Aurora A durch die ATM/ATR Kinasen bewerkstelligt wird, konnten wir durch den ATM/ATR Inhibitor Koffein zeigen. Ausserdem konnten wir durch Blockierung von Chk1 mit dessen Inhibitor UCN01 und siRNA zeigen, dass das Signal an Aurora A über einen Chk1-abhängigen Signalweg geleitet wird. Diese Resultate wurden zusätzlich durch Experimente mit einer Zelllinie, welche defizient ist in Chk2 (HCT15), verifiziert. Eine Punktmutation in Aurora A, S342 zu A, führt zu einem aktiven Enzym, das nicht mehr durch DNS-Schäden deaktiviert werden kann. Die S342 Phosphorylierungsstelle wurde bereits früher als eine negative Regulationsstelle postuliert. Diese Stelle liegt direkt neben einem der Bindemotive für PP1, einem Aurora A Interaktionspartner. Nach Behandlung mit Etoposid verringert sich die Interaktion zwischen diesen zwei Proteinen sehr stark (Krystyniak A. et al, manuscript submitted). Die S342 Mutation zu Alanin, das nicht phosphoryliert werden kann, verhindert die Ablösung der Phosphatase vom Komplex. Auf der anderen Seite haben wir herausgefunden, dass eine Mutation an derselben Stelle zu einem Aspartat, welches eine ständige Phosphorylierung imitiert, die Bildung des Komplexes aus PP1 und Aurora A verhindert. Zwei verschiedene Ansätze wurden gewählt um die Frage zu untersuchen, ob Aurora A in vorhergehend geschädigten Zellen eine mitotische Zellteilung einleiten kann. Transiente Transfektion von Zellen mit aktiven Formen von Aurora A (Wildtyp oder S342A, aber nicht mit dem kinase-inaktiven S342D Aurora A) hat den Zellen nicht erlaubt die Zellzyklusblockade, welche durch DNS Schäden induziert wurde, zu überwinden und mit der Mitose fortzufahren. Da eine Transfektion auch experimentelle Nachteile mit sich bringt, wie lange Transkriptions- und Translationszeiten oder eine Überexpression des Proteins, wurden direkt aktives Protein in Zellen transduziert, welche in der G2 Phase arretiert waren, gleich nachdem Doppelstrangbrüche induziert wurden. Dies hat den Zellen ermöglicht sogleich mit der Mitose zu beginnen, obwohl die Schäden noch nicht repariert worden waren. Molekular betrachtet ergibt sich, dass aktives Aurora A die Wiederaufnahme des Zellzyklus über eine Reaktivierung von Cdk1 erwirkt. Daher spielt Aurora A eine Schlüsselrolle im Signalweg oberhalb von Cdk1 - mindestens solange DNS Schäden bestehen. Aurora A wird ebenso wie andere Mitglieder dieser Proteinfamilie durch Phosphorylierung reguliert. Die Phosphorylierung einer konservierten Aminosäure von Aurora A, Threonin 288, ergibt eine beträchtliche Steigerung der Kinaseaktivität. Dieser Baustein befindet sich in einer Schlaufe in der katalytischen Domäne. Wir konnten zeigen, dass die Phosphorylierung von T288 möglicherweise durch einen intermolekularen Autophosphorylierungsmechanismus stattfindet. Ausserdem konnten wir zeigen, dass PKA in vivo nicht involviert ist in die Phosphorylierung von T288, obwohl diese Kinase früher in vitro als dafür verantwortlich befunden wurde. Wie niemand gedacht hätte, wurde eine Phosphorylierung dieser Stelle auch in DNS geschädigten Zellen gefunden. Das Ausmass der Phosphorylierung war dasselbe wie in mitotischen Zellen. Da Aurora A unter solchen Umständen nicht aktiv ist, wie wir durch unsere Kinase Tests zeigen konnten, müssen auch andere Mechanismen in der Steuerung der Aktivität eine Rolle spielen. The major mission of the cell division is a faithful and complete duplication of the genome with equal partition of chromosomes into subsequent cell generations. Progression through different stages of the cell cycle is governed by the activity of several members of the Cyclin-dependent kinase family, each pairing with the separate class of Cyclin. In higher eukaryotes, transition from G2 to M phase and completion of mitosis requires action of Cyclin B paired with Cdk1. Cdk1 is tightly regulated by phosphorylation/dephosphorylation processes and only full activation of Cyclin B/Cdk1 complex triggers the initiation of mitosis. Although the role of Cdk1 is crucial and Cdk1 remains the major regulator of mitosis, recent studies have broadened our knowledge of cell division, revealing the presence and importance of other protein kinases. Centrosome maturation and chromosome segregation require the action of Polo-like kinases, whereas separation of centrosomes seems to be regulated by the kinase Nek2. An important role in centrosome separation, chromosome bi-orientation and cytokinesis has been postulated for Aurora family members. Genomic stability is under constant threat not only from the products of normal cellular metabolism, but also from radiation and chemicals present in the environment. To ensure proper cell division upon the occurrence damage to DNA, checkpoints are triggered and result in slowing or stopping cell cycle transitions. This, in turn, enables the repair of damage or, when it is too extensive, facilitate the triggering of cell death. Normal cells possess a full complement of cell cycle checkpoints, whereas cancer cells, in most cases, acquire mutations that result in bypass of the checkpoints. Nonetheless, the G2 checkpoint is operative also in cancer cells, since division with incompletely duplicated or damaged DNA is incompatible with life. At the molecular level the G2 checkpoint prevents cells from entering mitosis through inactivation of Cyclin B/Cdk1. This occurs in an ATM/ATR-dependent manner and involves Chk1/Chk2-mediated sub-cellular sequestration and inhibition or degradation of members of the Cdc25 family of phosphatases, which normally activate Cdk1 at the G2/M boundary. It has been recently discovered that kinases involved in spindle formation, like Plk1, Nek2 and Aurora B, play important roles in the cellular response to DNA damage. In the studies presented in this dissertation I used etoposide, a topoisomerase II poison, to create double strand breaks in DNA, in order to elucidate the role of Aurora A in the DNA damage response. I found that Aurora A indeed is one of the targets of the double-strand break response in G2/M phase (Krystyniak A. et al, 2006). The kinase activity of the enzyme was actively inhibited upon etoposide treatment and this was accompanied by prolonged accumulation of the protein. I also addressed the issue of dependence between Aurora A and Cdk1, showing that the former is not downstream of the latter, but rather inhibition of Aurora A and Cdk1 by DNA damage occurs independently. By using caffeine, an ATM/ATR inhibitor, I showed that Aurora A de-activation in response to DNA damage was dependent on those kinases. More precisely, using cell lines deficient in ATM or conditionally expressing kinase-dead ATR, I was able to confirm that signalling to Aurora A was mediated through ATM. Further, by means of specifically blocking Chk1 with its inhibitor UCN01 or by using siRNA to Chk1, I showed that the signals were delivered to Aurora A via a Chk1-dependent pathway. Those results were additionally confirmed by experiments with cells functionally deficient in Chk2 (HCT15). Looking for the mechanism responsible for Aurora A inhibition, I found that the point mutation S342 to A resulted in a mutant that was active and could not be inhibited by DNA damage. S342 was already postulated as a negative site and it is located directly next to one of the binding motifs for PP1 – a known Aurora A interaction partner. Upon etoposide treatment, however, the interaction between Aurora A and PP1 is highly diminished (Krystyniak A. et al, manuscript submitted). Using the point mutant A342 of Aurora A I found that mutation to non-phosphorylable alanine prevents releasing of the phosphatase from the complex. On the contrary, mutation of the same site to aspartic acid, to mimick constitutive phosphorylation, resulted in complete abolishment of binding, irrespective of the presence of DNA damage. Finally, I took advantage of two independent approaches to examine the possibility that reconstitution of Aurora A activity in DNA damaged cells may trigger mitotic cell division. Transient transfection of cells with active (wild-type or S342A) but not with inactive (kinase-dead or S342D) forms of Aurora A, enabled them to bypass the DNA damage-induced cell cycle arrest and proceed to mitosis. To avoid large overexpression of proteins in transfection assays and given that such method requires time for the protein to be expressed, I used a more appropriate approach. This allows rapid transduction of proteins in the cell in a manner compatible with the kinetic of the G2 arrest in response to DNA damage. To this end, I directly transduced active AuroraA isoforms into G2-arrested cells, immediately after inducing double-strand breaks in DNA. This resulted in mitotic entry, despite the unrepaired damage. A closer look to the molecular mechanism underlying progression to mitosis in these conditions revealed that active Aurora A promoted reactivation of Cdk1, thus indicating that Aurora A plays a key role upstream of Cdk1, at least under DNA damage conditions. Aurora A, similarly to other members of the family, is known to be regulated by phosphorylation. Phosphorylation of a conserved residue, T288, localized in the activation loop of the catalytic domain of the kinase, results in significant increase of Aurora A kinase activity. I was able to show that phosphorylation of T288 may occur through an intermolecular autophosphorylation mechanism. Moreover, I found that PKA, previously claimed to be the kinase responsible for this event in vitro, was not involved in T288 phosphorylation in vivo. Surprisingly phosphorylation of this site, which is a direct indicator of the activity of the kinase, was found also in DNA-damaged cells to an extent comparable, or even higher than in mitotic cells. This situation is reminding of Cdk1, where phosphorylation at the T-loop residue T161 is hierarchically less important than inhibitory phosphorylation at the ATP-binding site. This finding points to presence of other, maybe structural, mechanisms responsible for the activity of Aurora A that remain to be discovered