BRCA 2 mis-splicing: regulación de los exones 17 y 18

Abstract

Resumen del trabajo presentado al I Congreso Interdisciplinar en Genética Humana, celebrado en Madrid del 25 al 28 de abril de 2017.[Objetivos]: El rastreo de mutaciones en BRCA2 ha identificado un gran número de variantes de significado clínico desconocido (VUS). Nuestro objetivo es investigar el impacto de este tipo de variantes en el splicing de los exones 17 y 18 de BRCA2, así como caracterizar elementos reguladores en los mismos que constituyan hotspots para variantes de splicing. [Material y Método]: Se construyó un minigen con los exones 14-20 de BRCA2 en el vector pSAD®. En él, se evaluaron 52 variantes seleccionadas a través de programas de predicción de splicing. Cada una de ellas, fue introducida en el minigen mediante mutagénesis dirigida y ensayada en células MCF7. El estudio de regulación se llevó a cabo mediante microdeleciones, ensayos de pulldown y siRNAs. [Resultados]: El minigen wild type produjo un transcrito estable de tamaño (1.802nt) y estructura (V1-[BRCA2_exons_14-20]-V2) esperada. El mapeo mediante microdeleciones reveló regiones esenciales en el extremo 3' del exón 17 (c.7944-7973) y en el 5' del exón 18 (c.7979-7988, c.7999-8013). Estas contienen secuencias de unión a proteínas SR, importantes en el reconocimiento de los exones. Por otro lado, 30/52 variantes, provocaron alteraciones en el splicing. Se encontraron más de 16 tipos de transcritos diferentes, siendo el skipping el evento más común. Encontramos alteraciones en un amplio número de elementos de splicing, incluidos los sitios canónicos (15), sitios alternativos de novo (3), tracto de polipirimidinas (3) y enhancer/silenciadores (9). Cabe destacar que 18 de las variantes estudiadas podrían ser reclasificadas como patogénicas, lo cual supone un 28.6% de las variantes patogénicas reportadas en los exones 17 y 18 de BRCA2. [Conclusiones]: Las mutaciones de splicing son especialmente prevalentes en los exones 17 y 18 debido a la presencia de ESEs activos. Los minigenes son una herramienta valiosa para discriminar entre variantes patogénicas y neutras, así como para estudiar los mecanismos reguladores del procesamiento del RNA mensajero.Peer Reviewe