Recientemente, el metabolismo de los aminoácidos aromáticos en levaduras se ha relacionado con la síntesis de moléculas bioactivas (melatonina, serotonina, tirosol, hidroxitirosol, etc...) que podrían ser relevantes desde diferentes aspectos relacionados tanto con la regulación de las levaduras como con la salud humana. Las actividades de estos compuestos como potenteantioxidante y otros aspectos beneficiosos para la salud del consumidor hacen que sea realmente interesante estudiar su síntesis. Sin embargo, se conoce poca información sobre la síntesis de estas moléculas bioactivas por la levadura porque es un tema de estudio muy reciente. Por tanto, la hipótesis de trabajo de la presente tesis consiste en que a través de una mejor comprensión del amino aromático vías de metabolismo ácido en la levadura S. cerevisiae, podemos aumentar el contenido de moléculas bioactivas en productos de fermentación alcohólica. Por lo tanto, el metabolismo de la levadura puede aumentar el contenido de moléculas bioactivas en bebidas y alimentos fermentados, lo que podría tener un impacto en la salud del consumidor y que sin duda incrementaría el valor agregado de estas bebidas, posicionándolas mejor en un entorno cada vez más competitivo y global.
En este contexto, el objetivo principal de este trabajo de tesis fue estudiar los mecanismos moleculares y fisiológicos implicados en la producción de compuestos bioactivos derivados del metabolismo de los aminoácidos aromáticos, principalmente compuestos derivados del triptófano como la melatonina y la serotonina, en S. cerevisiae. Al inicio de la tesis adaptamos y configuramos una técnica simple, rápida y de bajo costo para detectar la presencia demelatonina en muestras intracelulares de S. cerevisiae basadas en voltamperometría, la cual nos ayudó a determinar la producción de melatonina intracelular. Además, evaluamos el posible efecto de la melatonina intracelular en la cepa de laboratorio BY4743 en presencia y ausencia de H2O2 y radiación UV. Nuestros resultados demuestran que la melatonina intracelular es un antioxidante eficaz y una molécula fotoprotectora para la luz UV en S. cerevisiae.
Con respecto a la vía biosintética de la melatonina, aún se desconoce qué actividades o genes están involucrados en esta vía en la levadura. Para desvelar la vía biosintética de la melatonina en S. cerevisiae evaluamos los productos generado a partir de diferentes sustratos de la ruta (L-triptófano, 5-hidroxitriptófano, serotonina, nacetilserotonina, triptamina y 5-metoxitriptamina), en la cepa de levadura de vino QA23 en diferentes etapas de crecimiento por HPLC-MS/MS. Además con el fin de identificar los genes que responden a la síntesis de melatonina en levaduras, realizamos un análisis BLAST utilizando las secuencias de proteínas de animales y plantas. Los genes seleccionados como ortólogos putativos, así como un gen positivo como control (de animales o plantas), se sobreexpresaron tanto en S. cerevisiae y E. coli. Es importante destacar que nuestros resultados sugirieron que el único gen que se ha propuesto como homólogo de la arilalquilamina N-acetiltransferasa de vertebrados en levadura, PAA1, puede no ser el exclusive enzima en la acetilación de arilalquilaminas como serotonina, triptamina y 5-metoxitriptamina en S. cerevisiae.
Finalmente, construimos una cepa de S. cerevisiae modificada por integración múltiple en el genoma de E. coli complejo de hidroxilasa HpaBC para producir en exceso hidroxitirosol. Posteriormente, varios cambios en la levadura metabolismo (incluida la sobreexpresión de genes ARO, como ARO3, ARO4, ARO7 y ARO10, y estos mismos genes con mutaciones específicas generadas por mutagenesis dirigida) para aumentar el flujo de la ruta hacia la síntesis de tirosol, el alcohol superior derivado del catabolismo de la tirosina. La combinación de la sobreexpresión de ARO4K229L junto con la integración de HpaBC mostró el mayor efecto en la producción de hidroxitirosol alcanzando 374.5 mg/L en experimentos con matraces excediendo la producción en más de 230.000 veces a la de la cepa control.Recently, the metabolism of aromatic amino acids in yeasts has been linked to the synthesis of
bioactive molecules (melatonin, serotonin, tyrosol, hydroxytyrosol, etc.) that could be relevant from different
aspects related to both yeast regulation and human health. The activities of these compounds as a potent
antioxidant and other aspects beneficial to consumer health makes it really interesting to study its synthesis.
However, few information is known about the synthesis of these bioactive molecules by yeast because it is a
very recent topic of study.
Therefore, the working hypothesis of the present thesis is: Through a better understanding of the aromatic amino
acid metabolism routes in S. cerevisiae yeast, we can increase the content of bioactive molecules in products of
alcoholic fermentation. Thus, yeast metabolism can increase the content of bioactive molecules in fermented
beverages and foods, which could have an impact on the health of the consumer and which will undoubtedly
increase the added value of these beverages, better positioning them in an increasingly competitive and global
market. In this context, the main objective of this thesis work was to study the molecular and physiological
mechanisms involved in the production of bioactive compounds derived from the aromatic amino acid
metabolism, mainly tryptophan derived compounds such as melatonin and serotonin, in S. cerevisiae.
In this thesis we adapt and set up a simple, rapid, and low-cost technique for detecting the presence of
melatonin in S. cerevisiae intracellular samples based on voltammetry. Also, we evaluated the possible effect of
melatonin on BY4743 laboratory strain in the presence and absence of H2O2 and UV radiation. Our results
demonstrate that intracellular melatonin was an efficient antioxidant and UV protector molecule in S. cerevisiae.
Regarding melatonin biosynthetic pathway, it is still far unknown which activities or genes are involved in this
pathway in yeast. To unveil the melatonin biosynthetic pathway in S. cerevisiae we evaluated the products
generated from different substrates of the route (L-tryptophan, 5-hydroxytryptophan, serotonin, Nacetylserotonin, tryptamine, and 5‐methoxytryptamine), in the wine yeast strain QA23 at different stages of
growth by HPLC-MS/MS. Besides in order to identify the genes that respond to the synthesis of melatonin in
yeasts, we performed a BLAST analysis using the protein sequences of animals and plants. The genes selected
as putative orthologs, as well as a positive gene as a control (from animals or plants), were overexpressed both
in S. cerevisiae and E. coli. Importantly, our results suggested that the only gene that has been proposed as
homolog of the arylalkylamine N-acetyltransferase of vertebrates in yeast, PAA1, may not be the exclusive
enzyme in the acetylation of arylalkylamines such as serotonin, tryptamine and 5-methoxytryptamine in S.
cerevisiae.
Finally, we constructed a S. cerevisiae strain modified by multiple integration into the genome of the E. coli
hydroxylase HpaBC complex in order to overproduce hydroxytyrosol. Subsequently, several changes in yeast
metabolism (including overexpression of ARO genes, suchas ARO3, ARO4, ARO7 and ARO10 as well as the
specific mutations on some of these genes) were made to increase the flow of the route to the synthesis of
tyrosol, the higher alcohol derived from tyrosine catabolism. The combination of ARO4K229L overexpression
together with HpaBC integration showed the greatest effect on hydroxytyrosol production achieving 374.5 mg/L
in shake flask experiments which exceeded the production by more than 230,000 times that of the control strain
