Fusarium oxysporum es el hongo fitopatógeno de suelo causante de la marchitez vascular, una enfermedad fúngica que origina importantes pérdidas económicas en una gran variedad de cultivos de interés agronómico. F. oxysporum f. sp. dianthi (Fod) es la ‘forma specialis’ que causa la marchitez vascular en clavel (Dianthus caryophyllus). Actualmente no existe ningún método de control eficiente para esta enfermedad, y por ello diversos estudios se han dirigido a la búsqueda de nuevas herramientas de control, incluyendo la utilización de micovirus como agentes de control biológico de los hongos fitopatógenos. Los micovirus son virus que infectan hongos. Estos virus se han descrito infectando a la mayoría de grupos taxonómicos de hongos, incluyendo hongos fitopatógenos. La mayoría de estos virus poseen genomas de ARN, de doble cadena (dsRNA) o de cadena sencilla (ssRNA), aunque se han descrito unos pocos con genomas de ADN circular (ssDNA). Generalmente, los micovirus carecen de una vía de infección extracelular, y solo se transmiten entre aislados mediante anastomosis hifal (transferencia horizontal), o durante la producción de esporas (transferencia vertical). La mayoría de las infecciones por micovirus son crípticas, es decir, no tienen un efecto sobre su huésped fúngico, pero en algunos casos la infección viral se ha asociado a la alteración de determinados caracteres fenotípicos, siendo el de mayor relevancia la reducción de la virulencia (hipovirulencia). En estudios recientes se ha identificado y caracterizado el micovirus ‘Fusarium oxysporum f. sp. dianthi virus 1’ (FodV1), detectado infectando una cepa de F. oxysporum f. sp. dianthi. Hasta el momento, FodV1 es el único micovirus de F. oxysporum que ha sido asociado a la inducción de hipovirulencia. En esta tesis se ha usado la microscopia laser confocal y dos cepas isogénicas de Fod, infectada y no infectada con FodV1, marcadas ambas con el gen que expresa la proteína fluorescente GFP, para analizar el efecto del micovirus sobre el patrón de colonización fúngica en el sistema vascular de la planta. Los resultados obtenidos han demostrado que la infección por FodV1 produce una disminución en la velocidad y una restricción en la distribución espacial de la colonización fúngica en el interior de la planta. Además, también se ha analizado la incidencia de infecciones por FodV1 en una colección de 221 aislados de Fod obtenidos entre 2008 y 2012 en la misma área geográfica que la cepa originalmente infectada, observándose finalmente una baja incidencia de la infección viral entre los aislados analizados (<2%). Como continuación de la búsqueda de micovirus con potencial como agentes de virocontrol de las fusariosis vasculares, en esta tesis se han identificado nuevos micovirus que se encuentran infectado aislados de Fod. El primer micovirus identificado y caracterizado molecularmente ha sido ‘Fusarium oxysporum f. sp. dianthi hypovirus 2’ (FodHV2), detectado en un aislado de F. oxysporum f. sp. dianthi procedente de Marruecos. El genoma de FodHV2 tiene una longitud de 9,444 pb excluyendo la cola poli(A), y un único marco abierto de lectura (ORF) que codifica una poliproteína. Esta poliproteína contiene 3 dominios altamente conservados de UDP glucosa/esterol glucosiltransferasa, una polimerasa dependiente de ARN (RdRp), y una ARN helicasa viral. Además, se han identificado tres residuos de cisteína, histidina, y glicina en la región N-terminal, que podrían representar el sitio catalítico de una papain like-proteasa. La secuencia genómica completa de FodHV2 se ha comparado con la de otros micovirus en el género Hypovirus. Los resultados de esta comparación y del análisis filogenético apoyan la distinción, recientemente propuesta por otros autores, de tres géneros (Alphahypovirus, Betahypovirus, and Gammahypovirus) dentro de la familia Hypoviridae, e identifican a FodHV2 como un nuevo miembro del grupo de los Betahipovirus. El efecto biológico de FodHV2 en su aislado portador ha sido determinado utilizando dos cepas isogénicas, infectada y no infectada con FodHV2, obtenidas mediante transferencia horizontal del hipovirus via anastomosis hifal. La comparación de ambas cepas mostró que FodHV2 no tiene efecto sobre el crecimiento vegetativo, la conidiación, ni la virulencia de su aislado hospedador. FodHV2 es el primer hipovirus que se describe infectando una especie F. oxysporum, y además es el primero descrito en un aislado procedente de Africa. El segundo micovirus identificado en esta tesis ha sido el micovirus ‘Fusarium oxysporum f. sp dianthi mitovirus 1’ (FodMV1), detectado en un aislado de F. oxysporum f. sp. dianthi procedente de Colombia. FodMV1 posee un genoma de 2,313 pb de longitud, en el que se ha identificado un único ORF que codifica una RdRp viral. Una búsqueda de homología usando la secuencia nucleotídica y el programa BlastX mostró que FodMV1 es un nuevo miembro del género Mitovirus en la familia Narnaviridae. Una de las características de los mitovirus es que se replican en la mitocondria. De acuerdo con esto, el genoma de FodMV1 presenta una serie de características comunes al resto de mitovirus, como son una alta concentración de A+U (58.8%) y la presencia de un número de codones UGA, que codifican el aa triptófano en vez de una señal de ‘stop’ cuando se aplica el código genético mitocondrial. Asimismo, los extremos 5’- y 3’- UTR presentan una estructura secundaria característica también de mitovirus. El análisis filogenético sitúa a FodMV1 en un clado separado del resto de mitovirus que infectan otras especies de Fusarium. FodMV1 parece tener una relativamente alta incidencia, ya que se ha identificado infectando a otros 22 aislados de Fod. Entre estos aislados infectados existen aislados procedentes de España (18) y Colombia (4). La presencia del mismo mitovirus en aislados de zonas geográficas tan separadas sugiere una dispersión de la infección viral a través de la comercialización de esquejes de clavel entre ambos países.Fusarium oxysporum is a soilborne fungal pathogen that causes vascular wilt disease in a wide number of agronomically important crops. F. oxysporum f. sp. dianthi (Fod) is the ‘forma specialis’ that causes vascular wilt in carnation (Dianthus caryophyllus). Currently there is no efficient method for the control of this disease, and therefore several studies have been directed to the search for new control tools, including the use of mycoviruses as biological control agents of phytopathogenic fungi. Mycoviruses are viruses that infect fungi. They have been described infecting all major taxonomic groups of fungi, including phytopathogenic fungi. The majority of mycoviruses have double-stranded or single-stranded RNA genomes. Generally, mycoviruses lack an extracellular route of infection and are transmitted by hyphal anastomosis between isolates (horizontal transmission), and during the production of spores (vertical transmission). Most mycovirus-infections are cryptic, that is, they do not have an effect on their hosts, but in some cases the viral infection has been associated to the alteration of particular phenotypic traits of the fungal host, including the induction of hypovirulence. In recent studies we have identified and characterized mycovirus ‘Fusarium oxysporum f. sp. dianthi virus 1’ (FodV1), found infecting a strain of Fod. Till now, FodV1 is the only mycovirus that has been associated to the induction of hypovirulence in F. oxysporum. In this thesis, we have used confocal laser scanner microscopy and two isogenic GFP-labelled strains of F. oxysporum f. sp. dianthi, infected and not infected with FodV1, to analyze the effect of the mycovirus on the plant colonization pattern of its fungal host. Results demonstrate that FodV1 decreases the speed and alters the spatial distribution of the fungal colonization into the plant. We have also analysed the incidence of FodV1-viral infections in a collection of 221 isolates sampled between 2008 and 2012 in the same geographic area where the originally infected isolate was obtained. Results evidenced a very low (2%) incidence of viral infections. These results provide the first microscopic evidence about the effect of a hypovirulence-inducing mycovirus on the pattern of plant colonization by its fungal host. As a continuation of the search for mycoviruses with potential as virocontrol agents of vascular fusariosis, in this thesis we have identified and characterized new mycoviruses that are infecting F. oysporum f. sp. dianthi isolates. The first mycovirus identified has been ‘Fusarium oxysporum f. sp. dianthi hypovirus 2’ (FodHV2), found infecting a strain of F. oxysporum f. sp. dianthi from Morocco. The genome of FodHV2 is 9,444 nucleotides (nt) long excluding the poli(A) tail, and has a single open reading frame (ORF) encoding a polyprotein. The polyprotein contains three highly conserved domains of UDP glucose/sterol glucosyltransferase, RNA-dependent RNA polymerase, and viral RNA helicase. In addition, some particular residues of Cys, Hys, and Gly were detected in the N-terminal region that could represent the catalytic site of a former papain-like protease. The complete genomic sequence of FodHV2 has been compared with that of other mycoviruses in the genus Hypovirus. Results from this comparison and from phylogenetic analyses support the distinction, recently proposed by other authors, of three genera (Alphahypovirus, Betahypovirus, and Gammahypovirus) within the family Hypoviridae, and identifies FodHV2 as a new member of the Betahypovirus group. The biological effect of FodHV2 on the fungal host has also been determined using two isogenic isolates, infected and no-infected with the mycovirus, obtained by horizontal transference of the virus through hyphal anastomosis. Comparison of the infected and non-infected isogenic strains showed that FodHV2 did not alter the vegetative growth, neither the conidiation, nor the virulence of its fungal host. FodHV2 is the first member of the family Hypoviridae identified in F. oxysporum. Another unique feature of FodVH2 has to do with its geographical origin, because it is the first hypovirus identified in a fungal strain from the African continent. Another mycovirus identhified in this thesis has been ‘Fusarium oxysporum f. sp dianthi mitovirus 1’ (FodMV1), found infecting a strain of F. oxysporum f. sp. dianthi from Colombia. The genome of FodMV1 is 2,313 nt long, and comprises a 172-nt 5´-UTR, a 2,025-nt single ORF encoding a RdRp of 675 aa residues, and a 113-nt 3´-UTR. Homology BlastX searches identied FodMV1 as a novel member of the genus Mitovirus in the family Narnaviridae Mitoviruses are characterized by replicating within the mitochondria of the host. According to this, the genome of FodMV1 presents a series of characteristics common to the rest of mitoviruses, as are a high percentage of A+U (58.8%), and the presence of a number of UGA codons that encode the aa tryptophan rather than acting as stop codons as in the universal genetic code. Also, the 5’- and 3’- UTR regions of FodMV1, like other mitoviruses, can be folded into potentially stable stem-loop structures. Results from phylogenetic analyses place FodMV1 in a different clade than the rest of mitoviruses described in Fusarium spp. Incidence of FodMV1-infections is relatively high. Of particular interest is the fact that FodMV1 has been detected infecting Fod isolates from Spain and Colombia. The presence of the same mitovirus species infecting fungal strains from two geographical areas so far away could be explained by the the dispersion of the viral infection through the commercialization of infected carnation cuttings between both countries
