Gutiérrez-Aroca, Juan-Bautista

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Repositorio Institucional de la Universidad de Córdoba

 MESA REDONDA II 23 Reunión SAMPAC Málaga 11-12 Noviembre de 2010  33 ACTUALIZACIÓN DEL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO EN  NEUMONÍAS POR MYCOBACTERIAS. DR. JUAN BAUTISTA GUTIÉRREZ AROCA  Servicio Microbiología Hospital Universitario Reina Sofía Córdoba El Diagnostico Microbiológico de la Tuberculosis se inicia con El Dr. R. Koch, cuando demostró en unas muestras de esputos de pacientes tuberculosos, la existencia del agente etiológico, aplicando un método de tinción con azul de metileno, en el Con-greso de Fisiología de Berlín el 24 de Marzo del 1882. Con posterioridad consiguió cultivarlo en suero sanguíneo coagulado. Desde entonces ha habido una gran cantidad de descubrimientos que han hecho que en la actualidad podemos diferenciar en: La Baciloscopia. Siguiendo la tinción Franz Ziehl y Friedrich Neelsen y la fluores-cencia de Smithwick, basadas en la ácido-alcohol resistencia de la micobacteria. Se consigue  el diagnostico y permite iniciar un tratamiento de una forma sencilla, rápida y barata. El Cultivo. Demuestra la existencia de bacilos viables y permite clasificarlos en Com-plejo M. tuberculosis y M. atípicas, así como el estudio de resistencias. En este paso se ha conseguido también grandes avances, desde los cultivos manua-les, que como tipo queda el Loewenstein–Jensen a los Sistemas Automatizados, que en la actualidad el mas extendido es el Bactec 960TB MGIT. La Identificación. A partir de Cultivo Importante en el seguimiento de la patogenicidad de la especie, es donde mas avan-ces ha habido. En su inicio se baso en una Identificación Fenotípica (Criterios Bacte-riológicos Simples, Pruebas Bioquímicas, Cromatografía etc.) en la actualidad se utili-za la Identificación Genotípica, con el ahorro de tiempo y su exactitud, así como con la posibilidad de encontrar mutaciones en el ADN de las Micobacterias que se tradu-cen en resistencias a los distintos antituberculosos. Y así las distintas técnicas.  SONDAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Sondas comerciales de ADN (AccuProbe) no radiactivas que permiten identificar por hibridación con el ARN ribosómico micobacteriano, de forma rápida (2 horas) y es-pecífica, el complejo M. tuberculosis, el grupo M. avium-intracellulare, M. avium, M. intracellulare,  M. kansasii y M. gordonae. Estas sondas se pueden aplicar a partir de medios sólidos y líquidos.  Tienen como inconveniente el que sólo se puede realizar una identificación por prue-ba. Es importante no olvidar la frecuencia de cultivos micobacterianos mixtos en pa-cientes inmunodeprimidos. Ello obliga a realizar un subcultivo, a pesar de una identi-ficación positiva con la sonda de ADN para el grupo M. avium-intracellulare o M. tu-berculosis, sobre todo. INMUNOCROMATOGRAFIA Partiendo de los estudios de bioquímicos, inmunológicos y moleculares del Complejo  M. tuberculosis se han descubierto 33 proteínas secretadas por el Complejo M. tu-berculosis en su crecimiento activo. Una de las proteínas predominantes es el MPT64 del Complejo M. tuberculosis, no siendo secretada por otra Micobacteria del Género Micobacteria. Esta proteína MPT64 tiene capacidad antigénica por lo que se ha utilizado como prueba rápida por Inmunocromatografia al reaccionar frente a los Anticuerpos   MESA REDONDA II 23 Reunión SAMPAC Málaga 11-12 Noviembre de 2010  32 UTILIDAD DEL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO  EN NEUMONÍAS DE ATENCION PRIMARIA DRA. LORENA LÓPEZ-CERERO Unidad de Microbiología y Enfermedades Infecciosas.  Hospital Universitario Virgen Macarena Grupo de estudio de la infección de la Infección en Atención Primaria (GEIAP)  Actualmente, muchas guías clínicas siguen incluyendo la tinción y cultivo bacterioló-gico de la muestra de esputo para el manejo de la neumonía de la comunidad. La utilidad del esputo en el manejo inicial de esta infección, en una situación dónde mu-chas veces no se dispone de pruebas de imagen ni de biomarcadores, todavía está muy discutida a pesar de los avances en el diagnóstico microbiológico. La dificultad en la obtención de la muestra en Atención Primaria reduce significativamente su efi-cacia como prueba diagnóstica, ya que hasta un tercio de los pacientes no son capa-ces de expectorar, independientemente de su cuadro clínico, y un alto porcentaje de las muestras obtenidas son de baja calidad. A esto hay que añadir que la frecuencia con la que está implicado un patógeno bacteriano cultivable, como Streptococcus pneumoniae, Haemophilus, Legionella o enterobacterias,  puede suponer entre un 20-40% de las muestras realmente procesadas. Además, en estos casos, la rentabili-dad de la tinción y del cultivo está afectada por factores como el momento en el que se obtiene la muestra, por lo que hay que considerar el tiempo transcurrido desde del inicio de la terapia antibiótica por la disminución de la sensibilidad, tanto de la tinción como del cultivo, que implica. Debido a las dificultades intrínsecas del cultivo bacte-riano, los avances más notables en el diagnóstico microbiológico se han producido en las áreas de la detección de antígenos y de secuencias genéticas específicas. No obstante, son necesarias futuras evaluaciones sistemáticas del impacto en el manejo del paciente con neumonía de todas estas tecnologías, pero sobre un estudio que clarifique la relación entre las sensibilidades analíticas y el beneficio diagnóstico.  MESA REDONDA II 23 Reunión SAMPAC Málaga 11-12 Noviembre de 2010  34   monoclonales de ratón específicos. Esta técnica se puede realizar tanto a partir de medios líquidos como sólidos y su duración máxima, es de 15 minutos. GENOTYPE Mycobacterium CM Permite la identificacion de las siguientes especies: M. avium ssp, M.chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjec-tum, M. kansasii, M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum / M. ulcerans, M.tuberculosis complex, y M. xenopi. El proceso, se divide en tres paos; Aislamiento del ADN, a partir de un cultivo, la Am-plificacion multiplex con primers marcados con biotina y una Hibridacion reversa. La reaccion se produce en unas tiras de nitrocelulosa y para su interpretación se utili-za una plantilla del esquema de bandas obtenido. Siendo esta rapida y sencilla. GENOTYPE Mycobacterium AS Permite la identificacion de las siguientes especies: M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M. celatum, M. smegmatis, M. genavense, M. lentiflavum, M.hecheshornense, M.sulzagi / M. intermedium, M. plei , M.haemophilum, M. kansasii, M.ulcerans, M.gastri, M.asiaticum,y M. shimoidei. El procedimiento es igual al anterior. GENOTYPE MTBC Permite la diferenciación de las especies del C. M. tuberculosis. Identificando las si-guientes especies: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum. El procedimiento es igual a los anteriores. DETECCIÓN DE RESISTENCIAS Métodos Fenotípicos convencionales  Métodos basados en medios de cultivo sólidos.  Los métodos fenotípicos se basan en la realización del estudio de sensibilidad frente a los fármacos utilizados en el tratamiento. Se sigue el Método de las proporciones críticas, descrito por Canetti y Grosset, en que se comparan las colonias crecidas en diferentes diluciones con las presentes en medio sin antibiótico, interpretando el re-sultado a través de la proporción de colonias capaces de crecer en presencia del fármaco. La mayoría de métodos actuales se derivan de él. Inicialmente la técnica se diseñó para su utilización en medio de Löwenstein-Jensen y para los fármacos de primera línea, exceptuando la pirazinamida. Poco después se estandarizó para los medios 7H10 y 7H11 de Middlebrook. Más reciente el Método E-test, basado en la utilización de tiras impregnadas de antibiótico, aplicadas directamente sobre placas de medio de cultivo y que aporta la ventaja de determinar la CIM del fármaco gracias al gradiente de concentraciones del antibiótico a lo largo de la tira. Se trata de un método sencillo, aunque requiere cierta experiencia en su lectura.  Métodos Genotípicos. Métodos basados en mecanismos moleculares. GENOTYPE MTBDR PLUS Basado en la tecnología DNA-STRIP permite la Identificación del Complejo M. tuber-culosis y su posible resistencia frente a Isonicida y Rifampicina mediante la detección de las mutaciones del gen rpob. Se puede usar la técnica tanto a partir de muestras como de cultivo El procedimiento se basa en la Extracción del ADN, de cultivo o muestras respiratorias, Amplificación múltiple, y la Detección por Hibridación de los amplicones, a sondas unidos a una membrana. La lectura se realiza con una plantilla aplicada a las bandas donde se realiza la hibridación.  MESA REDONDA II 23 Reunión SAMPAC Málaga 11-12 Noviembre de 2010  35 GenoType MTBDR sl (2ª Linea) Igual fundamento que el anterior. Detecta mutaciones a: ETAMBUTOL, AMIKACINA, CAPREOMICINA, KANAMICINA, y QUINOLONAS MICROBIOLOGÍA MOLECULAR IDENTIFICACIÓN DIRECTA PCR Taqman MTB Test (Roche) Es una prueba de Amplificación del A. Nucleico para la detección cualitativa del ADN del Complejo M. tuberculosis en muestras respiratorias. Se basa en la Extracción del ADN de la Micobacteria, a continuación se realiza la Amplificación de este, mediante primers complementarios y por ultimo la Detección del ADN amplificado a tiempo real mediante, la escisión de sondas oligonucleotidas marcadas con doble marcador fluorescente, que permite detectar la acumulación del producto amplificado. Tiene un control interno que se amplifica independientemente. Genotype Mycobacterium Direct (GTMD)  Se trata de una nueva técnica de microbiología molecular basada en las tecnologías NASBA (Nucliec Acid Sequence-Based Amplification) y DNA-STRIPS® que nos per-mite mediante la amplificación de 23S rRNA, la detección de M. tuberculosis Com-plex, M. avium,  M. intracellulare, M. kansasii, y M. malmoense directamente de los especimenes clínicos  respiratorios descontaminados.  La prueba se divide en tres partes fundamentalmente:  - En la primera parte, se realiza la estabilización y el aislamiento de ARN de los espe-cimenes descontaminados mediante un método de captura (sonda de captura-bolitas magnéticas): - En la segunda parte de la técnica se produce la amplificación isotérmica del ARN mediante NASBA (Nucliec Acid Sequence-Based Amplification - Por último, en la tercera etapa del proceso, se realiza la detección del producto am-plificado mediante hibridación inversa  ésta, se realiza mediante un sistema automati-zado  (Profiblot Tecan®, Maennedorf, Switzerland), que nos permite la agitación, ca-lentamiento y dispensación de los reactivos necesarios para la reacción de detec-ción.  GENOTYPE MTBDR PLUS  Ya descrito GENOTYPE MTBDR sl (2ª Linea)                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                       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para muestras de pacientes no tratados con rifampicina. El sistema esta automatizado e integra, la Extracción mediante el procesamiento de la muestra, la Amplificación por la multiplicación del A. Nucleico y la Detección de las secuencias diana en muestras sencillas o complejas mediante ensayos de PCR y PCR trascriptasa inversa en tiempo real. El Sistema permite el procesamiento indivi-dual de cada muestra. Todo el proceso se realiza en cartuchos desechables, elimi-nando la posibilidad de contaminación cruzada entre las muestras.  MESA REDONDA II 23 Reunión SAMPAC Málaga 11-12 Noviembre de 2010  36 INNO-LiPA RIF.TB line probe assay.  Consiste en una amplificación mediante nested-PCR (reamplificación) de una región del gen rpoB que codifica la subunidad beta de la ARN polimerasa presente en todos los miembros del complejo M. tuberculosis, seguida de una hibridación inversa. El híbrido se detecta mediante una reacción calorimétrica que está automatizada (AUTOLiPA). El ensayo se completa en aproximadamente 12 horas. El sistema LiPA sirve para detectar el complejo M. tuberculosis y, a la vez, la resistencia a la rifampi-cina.    

Actualización del diagnóstico microbiológico en neumonías por mycobacterias

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Actualización del diagnóstico microbiológico en neumonías por mycobacterias

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