Efecto de la hipoxia en un modelo de esfera multicelular organotípica para el estudio del microambiente de células madre hematopoyéticas humanas

Abstract

Introducción: El microambiente medular está compuesto por factores biológicos, químicos y físicos, que actúan de forma sinérgica para modular y regular la proliferación, auto-renovación, diferenciación y migración de las células madre hematopoyéticas (CMH). Entre las poblaciones presentes en la médula ósea (MO), las células madre mesenquimales (CMM) y las células endoteliales (CE), a través de contacto célula-célula y por medio de la producción de factores solubles, tienen un efecto importante en la regulación de las CMH. La MO tiene niveles de oxígeno (O2) que oscilan entre el 1% y 6% lo cual se ha reportado también es de gran importancia en la regulación de las CMH. Es necesario que los estudios in vitro tengan en consideración varias características del microambiente in vivo para lograr hacer evaluaciones más precisas del microambiente de CMH en condiciones normales y patológicas. Por lo tanto, en el presente trabajo se desarrolló un modelo de esfera multicelular organotípica para el estudio de las CMH humanas, considerando la sinergia entre poblaciones celulares medulares y tensiones de O2, que permiten simular las condiciones celulares medulares in vivo. Metodología: Para la conformación de las esferas multicelulares se utilizó el sistema de levitación magnética; se aislaron CMH obtenidas de sangre de cordón umbilical, CMM obtenidas de MO y una línea celular endotelial de microvasculatura dérmica (CC-2811, Lonza®). Se realizaron cultivos a concentraciones de O2 atmosféricas (21% de O2) y a concentraciones fisiológicas (3% y 1% de O2). Se realizaron análisis de volumen, esfericidad y porcentaje de agregación celular durante 10 y 15 días en cultivo; evaluaciones de viabilidad, histológicas, inmunohistoquímicas; detección de antígenos hematopoyéticos y de la proteína Ki67; y se evaluó la producción de especies reactivas de O2 (EROs). Resultados: Después de 15 días en cultivo se obtuvieron esferas multicelulares con una viabilidad superior al 80%, los resultados de histología demostraron estructuras con ausencia de centro necrótico y se observó una mayor proliferación celular al 3% de O2. Se observó una mayor expresión de CD133 al 3% de O2 y una mayor expresión de CD33 y CD7 al 1% de O2. La ubicación de las células hematopoyéticas está en la zona intermedia entre la periferia y el centro de la esfera, y se encontró una disminución de las EROs en las esferas cultivadas al 1% de O2. Conclusión: Se logró desarrollar un modelo de esfera multicelular organotípica que sirve para evaluar diferentes características de las CMH humanas y su microambiente, y se estableció el efecto de la hipoxia en este modelo de cultivo in vitro. Lo encontrado en este estudio es un aporte importante para el desarrollo de organoides para el estudio de enfermedades hematológicas y de MO, y para la evaluación de sus respectivos tratamientos.Pontificia Universidad JaverianaColcienciasIntroduction: The bone marrow microenvironment is composed of biological, chemical and physical factors that act in a synergistic way to modulate and regulate the proliferation, self-renewal, differentiation and migration of hematopoietic stem cells (HSC). Among the populations present in the bone marrow (BM), mesenchymal stem cells (MSCs) and endothelial cells (EC), through cell-cell contact and through the production of soluble factors, have an important effect on the regulation of the HSC. The BM has oxygen levels (O2) that oscillate between 1% and 6% which has been reported is also of great importance in the regulation of HSC. It is necessary that the in vitro studies take into consideration several characteristics of the microenvironment in vivo in order to achieve more precise evaluations of the HSC microenvironment in normal and pathological conditions. Therefore, in the present work an organotypic multicellular spheroid model was developed for the study of human HSCs, considering the synergy between BM cellular populations and O2 tensions, which allow to simulate the in vivo BM microenvironment conditions. Methodology: For the conformation of the multicellular spheroids the magnetic levitation system was used; HSC obtained from umbilical cord blood, MSC obtained from BM and a dermal microvasculature endothelial cell line (CC-2811, Lonza®) were isolated. Cultures were carried out at atmospheric O2 concentrations (21% O2) and at physiological concentrations (3% and 1% O2). Volume, sphericity and percentage of cell aggregation analysis were performed during 10 and 15 days in culture; viability, histological and immunohistochemical evaluations; detection of hematopoietic antigens and Ki67 protein; and the production of reactive O2 species (ROS) was evaluated. Results: After 15 days in culture, multicellular spheroids with a viability higher than 80% were obtained, histology results showed structures with absence of necrotic center and a greater cellular proliferation was observed at 3% of O2. A higher expression of CD133 at 3% O2 ​​and a higher expression of CD33 and CD7 at 1% O2 was observed. The hematopoietic cells were localized in the intermediate zone between the periphery and the center of the spheroid, and a decrease of the ROS in the spheroids cultivated at 1% of O2 was found. Conclusion: It was possible to develop an organotypic multicellular spheroid model that can be used to evaluate different characteristics of human HSCs and their microenvironment, and the effect of hypoxia was established in this in vitro culture model. What is found in this study is an important contribution to the development of organoids for the study of hematological diseases and BM, and for the evaluation of their respective treatments.Magíster en Ciencias BiológicasMaestrí