Tesis (Doctor en Biotecnología)La lignocelulosa es la biomasa renovable más abundante en nuestro planeta. Está compuesta por lignina, pectina, celulosa y hemicelulosas. El xilano es el principal componente de las hemicelulosas. Está formado por una cadena principal de residuos P- 1,4-D-xilopiranósidos sustituida por diferentes tipos de residuos: metil glucuronato, Larabinofuranosa y acetato. La biodegradación del xilano es un proceso complejo que necesita la participación de una serie de esterasas y glicanasas. Entre estas Últimas se encuentran las a-L-arabinofuranosidasas (E.C. 3.2.1.55) que hidrolizan residuos de arabinosa unidos a la posición 2 y/ó 3 de la xilosa.
El hongo filamentoso Penicillium purpurogenum, utilizado en este trabajo como modelo de estudio, crece en diferentes fuentes de carbono natural, secretando al medio en que se
desarrolla una gran variedad de enzimas xilanolíticas, incluyendo tres a-Arabinofuranosidasas,
denominadas ABF 1,2 y 3.
Este trabajo está enfocado en completar la caracterización de ABF2 y principalmente en el estudio de ABF3. Las dos enzimas han sido purificadas a homogeneidad. El peso molecular determinado por electroforesis en condiciones desnaturantes es de 70.000 para ABF2 y 50.700 para ABF3.
Al analizar sus propiedades cinéticas, utilizando el sustrato sintético p-nitrofenil-a- arabinofuranósido (pNPAra), se observó que ambas siguen una cinética de Michaelis-
Menten, con valores de KM de 0,098 mM para ABF2 y 0,65 mM para ABF3. La temperatura óptima es de 60°C para ABF2 y de 50°C para ABF3. El pH óptimo es de 5,O para las dos ABFs. ABF3 muestra también actividad frente a p-nitrofeni1-B-Dxilopiranósido (pNPXyl) con una KM de 12 mM; es por lo tanto una enzima bifuncional.
La acción sobre sustratos naturales mostró que las tres ABFs (ABF1, 2 y 3) tienen diferente especificidad de sustrato; ABF 1 actúa sobre polisacáridos desramificandolos, ABF2 no actúa sobre polisacáridos y ABF3 muestra mayor preferencia por arabinoxilano y xilooligosacáridos. Estos resultados confirman la hipótesis que las ABFs cumplen distintas funciones en la biodegradación de la lignocelulosa.
El gen abf 3 y su cDNA fueron secuenciados y no se encontraron intrones. La proteína madura tiene 433 aminoácidos, con un peso molecular calculado de 47.305. El análisis de la secuencia de ABF3 mostró que es una proteína modular; posee un dominio catalítico y módulo de unión a carbohidratos. De esta forma, ABF3 es la primera enzima bifuncional modular de eucariontes descrita dentro de la Familia 43 de las Glicosil Hidrolasas.
Una posible aplicación de las a-L-arabinofuranosidasas ha sido estudiada en relación al aumento del aroma de los vinos. Se utilizó mosto de Moscatel de Alejandría para aislar los glicósidos a través de columnas C18 RP. La cantidad de monosacáridos (glucosa, arabinosa y xilosa) presentes en los glicósidos, fue determinada después de la hidrólisis ácida y fue comparada con la obtenida por hidrólisis enzimática. Para la hidrólisis enzimática se utilizaron las ABFs (1 y 3) y P-glucosidasa de P. purpurogenum. Las dos ABFs fueron activas frente a monoterpenil a-L-arabinofuranosilglucósidos con liberación de arabinosa. Si además se adicionaba P-glucosidasa se generaba glucosa y monoterpenos.
Estos resultados son comparables a los obtenidos en experimentos similares utilizando
preparaciones comerciales, lo que sugiere que las enzimas de P. purpurogenum pueden
ser utilizadas en esta aplicación en particular
