Publication number: ES2627007 A1 (26.07.2017)
Application number: P201600100  (26.01.2016)Método de extracción de biliproteínas en cultivos de microorganismos utilizando disoluciones de glicerol. El objeto consiste en obtener extractos de ficobiliproteínas a partir de cultivos de microorganismos (como microalgas o cianobacterias) utilizando un solvente ecológico e inocuo para la salud humana con mayores rendimientos de extracción, menor número de etapas y menores requerimientos energéticos que los actualmente utilizados ya que funciona incluso con biomasa húmeda. Se sumerge la biomasa en una disolución de glicerol a temperatura ambiente o temperatura controlada durante al menos 4 horas, se centrifuga y se obtiene el extracto rico en ficobiliproteínas directamente o bien mediante la adición, previo a la centrifugación, de un pequeño volumen de disolución buffer adecuada (como el buffer de disolución de ácido acético acetato de sodio pH 5.5 250 mM).Universidad de Almerí

Huertas Sánchez, Ana

Ibáñez González, María José

Mazzuca Sobczuk, Tania

Mazzuca, Marcia

Molina Grima, Emilio

Repositorio de Patentes de la Universidad de Almería

Método de extracción de biliproteínas en cultivos de microorganismos utilizando disoluciones de glicerol

Repositorio Institucional de la Universidad de Almería

Repositorio Institucional de la Universidad de Almería (Spain)

ES 2 627 007 A119 OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCASESPAÑA 1121Número de publicación: 2 627 007Número de solicitud: 20160010051 Int. CI.:C12N 1/12 (2006.01)(2006.01)C09B 61/0012 SOLICITUD DE PATENTE A154  Título: Método de extracción de biliproteínas en cultivos de microorganismos utilizandodisoluciones de glicerol71 Solicitantes:UNIVERSIDAD DE ALMERÍA  (100.0%)OTRI-UAL, Ctra. de Sacramento, s/n Edf. Central,planta baja04120 Almería  ES72 Inventor/es:MAZZUCA SOBCZUK , Tania ;IBÁÑEZ GONZÁLEZ , María José ;MOLINA GRIMA , Emilio ;HUERTAS SÁNCHEZ, Ana yMAZZUCA, Marcia22 Fecha de presentación:26.01.201643 Fecha de publicación de la solicitud:26.07.201757  Resumen:Método de extracción de biliproteínas en cultivos demicroorganismos utilizando disoluciones de glicerol.El  objeto consiste en obtener extractos def i c o b i l i p r o t e í n a s  a  p a r t i r  d e  c u l t i v o s  d emicroorganismos (como microalgas o cianobacterias)utilizando un solvente ecológico e inocuo para lasalud humana con mayores rendimientos deextracción, menor número de etapas y menoresrequerimientos energéticos que los actualmenteutilizados ya que funciona incluso con biomasahúmeda.Se sumerge la biomasa en una disolución de glicerola temperatura ambiente o temperatura controladadurante al menos 4 horas, se centrifuga y se obtieneel extracto rico en ficobiliproteínas directamente obien mediante la adición, previo a la centrifugación, deun pequeño volumen de disolución buffer adecuada(como el buffer de disolución de ácido acético acetatode sodio pH 5.5 250 mM).MÉTODO DE EXTRACCiÓN DE BILlPROTEíNAS EN CULTIVOS DE MICROORGANISMOS UTILIZANDO DISOLUCIONES DE GLICEROL. 5 SECTOR DE LA TÉCNICA La presente invención, se encuadra en el sector de la obtención de extractos de ficobiliproteínas a partir de biomasa de microorganismos como las microalgas o cianobacterias que son los más utilizados actualmente. Las ficobiliproteínas tienen 10 aplicaciones en la industria química, cosmética, farmacológica y alimentaria. ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN Existen diversos procesos para extraer biliproteínas a partir de microalgas y 15 cianobacterias cuya utilización depende principalmente de la especie de microalga que sirva como materia prima así como del posterior método de purificación a emplear. La etapa inicial suele consistir en la ruptura de la pared celular de la microalga en cuestión y se suele partir de biomasa seca y liofilizada. Los tratamientos mecánicos de ruptura celular (congelación-descongelación, ultrasonidos, etc ... ) pueden a veces 20 reemplazarse por métodos enzimáticos o químicos (utilizando enzimas como por ejemplo la lisozima, o tritón X-100). El principio fundamental de los métodos de extracción es el choque osmótico y la fuerza iónica, para lo cual se han utilizado extracciones utilizando tampón de acetatos, tampón de fosfatos e incluso acetona (Gombos, Csizmadia et al. 1984, Saxena 1988, Duerring, Schmidt et al. 1991 , 25 Tchernov, Minkova et al. 1999, Campanella, Crescentini et al. 2000, Bermejo, Acién et al. 2003, Ruiz 2012). Dependiendo de la técnica de purificación que se vaya a emplear en la etapa posterior un método resulta más atractivo que otro. Por ejemplo, para la purificación mediante 30 adsorción en lecho expandido, método que reduce el número de etapas necesarias con respecto a otros métodos convencionales, es necesario ajustar el pH a 5,5, de modo que a priori pareceria interesante realizar la extracción a este pH para evitar tener que diluir el extracto. Sin embargo, aplicando la técnica que se propone en esta invención, la obtención de extractos proteicos mucho más concentrados y con un 35 mayor rendimiento permitiría trabajar con menores cantidades de cultivo en las etapas 2 ES 2 627 007 A1 5 previas, y esto redundaría también en los costes económicos de obtención del bioproducto . . EXPLlCACIÓN DE LA INVENCiÓN Método de extracción de biliproteínas en cultivos de microrganismos utilizando disoluciones de glicerol. El objeto consiste en obtener extractos de ficobiliproteínas a partir de cultivos de microorganismos (como microalgas o cianobacterias) utilizando un solvente ecológico e inocuo para la salud humana con mayores rendimientos de 10 extracción, menor número de etapas y menores requerimientos energéticos que los actualmente utilizados ya que funciona bien con biomasa seca e incluso con biomasa húmeda. Se sumerge la biomasa en una disolución de glicerol a temperatura ambiente o 15 temperatura controlada durante al menos 4 horas, se centrifuga y se obtiene el extracto rico en ficobiliproteínas directamente o bien mediante la adición, previo a la centrifugación , de un pequeño volumen de disolución buffer adecuada (como el buffer de ácido acético-acetato de sodio pH 5.5 250 mM). 20 REALIZACiÓN PREFERENTE DE LA INVENCiÓN Modo de realización preferente 1. Se depositan 5±2 g de biomasa húmeda de la microalga Porphyridium cruentum en un 25 tubo Falcon de 50 mi, añadiéndosele con 20±5 mi de Glicerol (98% pureza) . Se realizan dos extracciones similares mediante el procedimiento siguiente: la mezcla homogenizada obtenida se deja en agitación continua durante 24 horas a 4°C. Después de esto, la mezcla se centrifuga. Del sobrenadante centrifugado se extrae 1 mi para la determinación de ¡3-ficoeritrina midiendo mediante espectrofotometría a una 30 longitud de onda de 280nm, 545nm, 565nm, 620nm y 650nm cada extracto. La concentración de ¡3-ficoeritrina (S-PE), en mg'mL-1) se calcula utilizando la siguiente ecuación: fJ - PE[mg'mZ-I ]= (OD56511 /11 -2.8-[R - PC]- 1.34-[APc D 12.7 3 ES 2 627 007 A1 5 Donde ODi indica densidad óptica del cultivo medida a la longitud de onda i en el espectrofotómetro y R_PC y APC se calculan utilizando las siguientes ecuaciones: A,..".[ .rrJ- IJ= (00650 nm - 0.19-0°620 ) rvL rrg 5.65 R - PC [mg'mr l ]= (OD62onm - 0.70D650 ) 7.38 El porcentaje de B-ficoeritrina extraída sobre la biomasa seca se calcula como: %BPEen labiomasa = ___ m_B_p_E_e.x_lr_a_íd_a __ m biomasahúmeda '(1 - x) 10 Siendo x los gramos de agua por gramo de biomasa húmeda y siendo mBPE la masa de B- ficoeritrina extraída a partir de la biomasa. La pureza de B ficoeritrina en el extracto obtenido se puede estimar utilizando el cociente de las densidades ópticas del extracto medidas a 545nm y 280nm, siendo mayor la pureza cuanto mayor sea ese cociente. 15 Para observar la ventaja de utilizar glicerol como solvente extractor estos resultados se han comparado con los de una extracción que sigue los mismos pasos pero utiliza tampón de acetatos de pH 5,5 concentración 250 mM, partiendo de la misma cantidad de biomasa. 20 Los resultados son los que se indican en la tabla 1. %BFE BFE Extraído con Solvente (mg) A54s1A280 respecto a la biomasa seca Tampón Acetato 4,93±0,42 1,39% 2,00±0,32 pH 5"5 250 mM Glicerol 27,67±4,9 5,42% 1,40±0,34 4 ES 2 627 007 A1 Tabla 1. Extracción de S-ficoeritrina mediante el ampliamente utilizado buffer de acetatos 250 mM (pH 5.5) Y extracción utilizando glicerol tal como se propone en la 5 presente patente de invención. Datos obtenidos a partir de la extracción con biomasa húmeda de Porphyridium cruentum. La utilización de glicerol al 98% de pureza para obtener extractos proteicos de S-ficoeritrina muestra una clara ventaja frente al uso del buffer de acetatos pH 5,5 250 10 mM tal como se aprecia en la tabla 1. A modo de ejemplo, cuando inicialmente se pesaron 5±0.1 g de biomasa húmeda centrifugada de la microalga, con un 93,5% de humedad, los 27,67±4,9 mg de ~-ficoeritrina extraída suponen un 5,42% sobre masa seca. Este porcentaje es muy superior al obtenido cuando se utiliza el ampliamente referenciado tampón de acetatos pH 5' 5 (250mM), donde la cantidad de ~-fícoeritrina 15 extraída es de 4,93±0,42 mg que representan un 1,39% sobre la masa de biomasa seca. Modo de realización preferente 2. Se depositan1±0.2 g de biomasa húmeda de cianobacteria en un tubo Falcon de 50 20 mi , añadiéndosele con 10±1 mi de Glicerol (98% pureza). Se realizan dos extracciones similares mediante el procedimiento siguiente: la mezcla homogenizada obtenida se deja en agitación continua durante 24 horas a temperatura ambiente. Después de esto, se añaden 5 mi de tampón de acetatos 250 mM pH 5,5 Y la mezcla se centrifuga inmediatamente. Del sobrenadante centrifugado se extrae 1 mi para la determinación 25 de C-ficocianina midiendo mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 280nm, 615nm, 620 nn, 650 nm y 652 nm. La concentración de C-ficocianina (S-PC), en mg 'mL-1) se calcula utilizando la siguiente ecuación: 30 C - PC[mg'mr l ] = (OD620nm - 0.4740D652 ) 5.34 El porcentaje de C ficocianina extraído sobre la biomasa seca se calcula como: %CPC en la biomasa = ___ m_c_p_C_e.:_XI_ra_íd_a _ m biomasa húmeda ' (1 - X) 5 ES 2 627 007 A1 5 Siendo mCPC la masa de C ficocianina extraída a partir de la biomasa. La pureza de C ficocianina en el extracto obtenido se puede estimar utilizando el cociente de las densidades ópticas del extracto medidas a 620nm y 280nm, siendo mayor la pureza cuanto mayor sea ese cociente. Para observar la ventaja de utilizar glicerol como solvente extractor estos resultados se han comparado con los de una extracción que sigue los mismos pasos pero utiliza tampón de acetatos de pH 5,5 concentración 250 mM, partiendo de la misma cantidad de biomasa. 10 Los resultados son los que se indican en la tabla 2: CPC %CPC Extraído con Solvente (mg) respecto a la As201A28o biomasa seca Tampón Acetato O,15±O,O2 1% 6 pH 5'5 250 mM Glicerol 4,95±O,5 33% 21 La utilización de glicerol al 98% de pureza para obtener extractos proteicos de C-ficocianina muestra una clara ventaja frente al uso del buffer de acetatos pH 5,5 250 mM tal se aprecia en la tabla 2. A modo de ejemplo, cuando inicialmente se pesaron 15 1,4±0.2 g de biomasa húmeda centrifugada de la microalga, con un 90,0% de humedad, los 4,95±4,9 mg de C-ficocianina extraída suponen un 33% sobre masa seca. Este porcentaje es muy superior al obtenido cuando se utiliza el ampliamente referenciado tampón de acetatos pH 5'5 (250mM), donde la cantidad de C ficocianina extraída es de 0,15 mg que representan apenas el 1 % del peso de la biomasa seca. 20 La pureza del extracto de C ficocianina obtenido con glicerol es también mayor que la pureza del extracto obtenido con disolución de acetatos. 6 ES 2 627 007 A1 REIVINDICACIONES 1. Proceso de extracción de ficobiliproteínas a partir de biomasa de 5 microrganismos como son las microalgas o cianobacterias que consiste en poner en contacto la biomasa con una disolución de glicerol que inicia el proceso de extracción. 2. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque las células a extraer pueden o no haber sufrido procesos de rotura celular previos a la extracción 10 con glicerol. 15 3. Procedimiento, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las células a extraer pueden o no haber sufrido un proceso de secado previo a la extracción con glicerol. 4. Procedimiento, según la reivindicación 1 en el cual a continuación o bien se separa la disolución de glicerol conteniendo las ficobiliproteínas (extracto de biliproteínas) o bien se adiciona a dicha mezcla una disolución capaz de disolver las ficobiliproteínas para proceder a separarlas de la biomasa, como puede ser por 20 ejemplo el buffer de acetatos pH 5,5 250 mM. 7 ES 2 627 007 A1    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS  ESPAÑA   21 N.º solicitud: 201600100 22 Fecha de presentación de la solicitud:  26.01.2016 32 Fecha de prioridad:   INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA    51  Int. Cl. :    C12N1/12 (2006.01) C09B61/00 (2006.01)   DOCUMENTOS RELEVANTES    Categoría  56                                                                Documentos citados  Reivindicaciones afectadas    A     A     A     A      WO 2014045177 A1 (ECOSYSTEM) 27/03/2014, Reivindicaciones 1-12;   ES 245829 A1 (UNIVERSIDAD DE ALMERIA) 15/09/2015, página 2, líneas 5 - 8; reivindicaciones 1-3;   FR 2453199 A1 (INSTITUT FRANCAIS DU PETROLE) 31/10/1980, página 6, línea 20 - página 8, línea 22;   FR 2789399 A1 (ALPHA BIOTECH) 11/08/2000, Todo el documento    1-4     1-4     1-4     1-4        Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la       misma categoría A: refleja el estado de la técnica    O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación      de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha       de presentación de la solicitud   El presente informe ha sido realizado  para todas las reivindicaciones    para las reivindicaciones nº:    Fecha de realización del informe 14.06.2017  Examinador M. Ybarra Fernandez  Página 1/4   INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA  Nº de solicitud: 201600100      Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)  C12N, C09B  Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)  INVENES, EPODOC                                 Informe del Estado de la Técnica    Página 2/4  OPINIÓN ESCRITA  Nº de solicitud: 201600100        Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 14.06.2017     Declaración          Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Reivindicaciones 1-4 SI   Reivindicaciones  NO       Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Reivindicaciones 1-4 SI   Reivindicaciones  NO       Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).  Base de la Opinión.-  La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.              Informe del Estado de la Técnica    Página 3/4  OPINIÓN ESCRITA  Nº de solicitud: 201600100     1. Documentos considerados.-  A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.  Documento Número Publicación o Identificación Fecha Publicación D01 WO 2014045177  A1 (ECOSYSTEM) 27.03.2014 D02 ES 245829  A1 (UNIVERSIDAD DE ALMERIA) 15.09.2015 D03 FR 2453199  A1 (INSTITUT FRANCAIS DU PETROLE) 31.10.1980 D04 FR 2789399  A1 (ALPHA BIOTECH) 11.08.2000  2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración  El documento D01 reivindica un método para extraer y estabilizar ficocianina a partir de al menos un material que lo contiene. Dicho procedimiento se caracteriza porque incluye una etapa de maceración del material o materiales en glicerol o una mezcla agua / glicerol.  El documento D02 describe un procedimiento que consiste en concentrar cultivos de microalgas mediante un proceso económico y de bajo consumo energético, pudiendo reaprovechar el glicerol residual de la síntesis de biodiesel. La disolución de glicerol constituye la solución osmótica, que se pone en contacto con el cultivo de microalgas a través de una membrana semipermeable. La diferencia de presión osmótica entre el cultivo y la disolución de glicerol hace que el agua se transfiera al glicerol, lográndose así, sin adición de químicos ni gato energético adicional, la concentración del cultivo.  El documento D03 describe un procedimiento para extraer el colorante azul contenido en algas cianofíceas, particularmente las del género Spirulina. El método comprende poner en contacto el alga marina fresca con una primera fase acuosa que contiene iones Ca2+, con una concentración preferida de 0,02 a 0,2 gramos por litro de iones; separar la primera fase acuosa y la masa de algas; poner en contacto la masa de algas con una segunda fase acuosa a un pH alcalino; y separar la segunda fase acuosa a un pH alcalino; y separar esta segunda fase acuosa, de la que se extrajo ficocianina, con la masa residual de las algas. Un paso adicional se utiliza para extraer carotenoides.  El documento D04 reivindica la producción de un extracto de un microorganismo fotosintético que comprende: cultivar el microorganismo; transferir las células al medio de inducción para aumentar la producción de metabolitos; lisar las células en frío; mezclar el lisado con un medio de separación; y separar fracciones solubles e insolubles del lisado por filtración tangencial, en frío, para producir un extracto crudo.  La invención de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 es nueva e implica actividad inventiva. (Artículos 6.1, 8.1 LP11/86).  Informe del Estado de la Técnica    Página 4/4  

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