Dissertação de Mestrado em Farmacologia Aplicada apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraNeuropeptide Y (NPY) is a 36 amino acid peptide that is abundantly distributed in the
central nervous system (CNS), including the retina. NPY acts through the activation of
several G protein-coupled receptors: Y1R, Y2R, Y4R and Y5R. It has been shown that this
peptide has neuromodulatory and neuroprotective roles in the retina, and it has been
associated with physiological and pathological conditions. Increasing evidence has shown that
NPY is a regulator of inflammatory processes, but its effects depend on cell types and
tissues, the type of NPY receptors involved and on factors present in the cellular milieu.
However, little is known about its potential inhibitory effects on pro-inflammatory processes
in the retina, especially controlling retinal microglia reactivity.
Microglia are the innate immune cells of the CNS and are involved in the maintenance
of retinal homeostasis. However, in response to retinal injury, activated microglia adopt
ameboid morphology, express inducible nitric oxide synthase (iNOS) and release neurotoxic
factors such as the pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6, and reactive oxygen
species (ROS), which can lead to neuronal degeneration. The detrimental effects of
overactivated microglia are thought to contribute to the pathogenesis retinal degenerative
diseases, such as diabetic retinopathy and glaucoma.
Since neuroinflammation is described to be involved in the pathogenesis of several
retinal degenerative diseases, we investigated the NPY effects, particularly via the Y1R
activation, on the modulation of microglia activation and inhibition of pro-inflammatory
processes in the retina.
To induce an inflammatory response, cultured retinal explants, primary retinal neural
mixed cultures and purified cultures of retinal microglial cells were exposed to
lipopolysaccharide (LPS), in the absence or presence of NPY or a Y1 receptor agonist
([Leu31, Pro34]-NPY) and/or antagonist (BIBP3226). Additionally, an animal model of retinal
degeneration, a retinal ischemia-reperfusion (I/R) injury model, was used. In this case, NPY
or [Leu31, Pro34]-NPY (LP-NPY) were injected intravitreally 1 h before ischemia and retinal
blood flow was restored for 8 h or 24 h. Several markers and parameters of the retinal
inflammatory status were evaluated, including the activation of retinal microglial cells, in
terms of changes in morphology and inducible protein expression, as well as the expression
and production of pro-inflammatory cytokines in the retina.
In cultured retinal explants, NPY was able to inhibit the alterations in retinal microglia
morphology, as well as the increase in iNOS expression and ROS production in retinal
microglia, triggered by LPS. Moreover, NPY inhibited IL-1β and IL-6 expression and production. Y1R activation mimicked the inhibitory effects of NPY on the LPS-induced
alterations in retinal microglia morphology and iNOS expression. In addition, activation of
Y1R inhibited the expression and production of all pro-inflammatory cytokines studied (TNF-
α, IL-1β and IL-6), indicating that Y1R appears to have a predominant role on the effects
mediated by NPY.
In the I/R injury model, intravitreal injection of NPY or LP-NPY before ischemia
inhibited morphological changes in retinal microglia induced by I/R 24 h after reperfusion.
Furthermore, 8 h after reperfusion the upregulation of TNF-α, IL-1β and IL-6, and the
production of TNF-α and IL-6, in ischemic retinas, was inhibited by NPY.
Altogether, these data provide evidence that NPY and Y1R activation are able to
regulate retinal microglia activation and inhibit the expression and production of neurotoxic
factors in the retina. Immunohistochemistry data and in vitro studies indicate that retinal
microglial cells primarily express iNOS and are the primary sources of ROS production
under pro-inflammatory conditions in the retina. These findings could point novel
physiological and therapeutic roles of NPY system in neuroinflammation, not only in the
retina, but also in the nervous system.O neuropeptídeo Y (NPY) é um peptídeo com 36 aminoácidos que se encontra
amplamente distribuído no sistema nervoso central (SNC), incluindo a retina. Os seus
efeitos são mediados através da ativação de vários recetores acoplados a proteínas G: Y1R,
Y2R, Y4R e Y5R e y6R. Este peptídeo pode atuar como neuromodulador e neuroprotetor na
retina, e tem sido associado a diversas doenças e processos fisiológicos. Evidências
crescentes têm demonstrado que o NPY é um regulador de processos inflamatórios,
dependendo os seus efeitos do tipo de tecidos e células em que atua, do tipo de recetores
envolvidos e dos fatores presentes no meio. No entanto, o seu potencial papel antiinflamatório
na retina, em particular no controlo da reatividade da microglia, é praticamente
desconhecido.
As células da microglia são células do sistema imunitário do SNC, e têm um papel na
homeostase da retina. No entanto, em resposta a lesões na retina, as células da microglia
ficam ativadas, adotando uma morfologia ameboide, expressam a isoforma indutível da
sintase do monóxido de azoto (iNOS), libertam substâncias neurotóxicas, como por
exemplo as citocinas pró-inflamatórias TNF-, IL-1 e IL-6, e espécies reativas de oxigénio
(ROS), o que pode contribuir para a morte neuronal. Pensa-se que os efeitos nocivos da
microglia ativada podem contribuir para a patogénese de doenças degenerativas da retina,
tais como a retinopatia diabética e o glaucoma.
Uma vez que se considera que a neuroinflamação está envolvida na patogénese de
várias doenças da retina, neste trabalho investigou-se os efeitos do NPY, e em particular da
ativação do recetor Y1 (Y1R), na modulação da ativação da microglia e na inibição da
resposta pro-inflamatória na retina.
Para induzir uma resposta inflamatória, expuseram-se culturas de explantes de retina,
culturas mistas de retina e culturas purificadas de microglia de retina a lipopolissacarídeo
(LPS), na ausência ou presença de NPY ou de um agonista ([Leu31, Pro34]-NPY) e/ou
antagonista (BIBP3226) do Y1R. Adicionalmente, foi utilizado um modelo animal de isquémiareperfusão
(I/R) da retina. Neste caso, o NPY ou o [Leu31, Pro34]-NPY (LP-NPY) foram
injetados no vítreo 1 h antes da isquémia, tendo sido utilizados dois tempos de reperfusão, 8
e 24 h. Foram avaliados diversos marcadores e parâmetros indicadores de inflamação na
retina, incluindo o estado de ativação das células da microglia, em termos de alterações
morfológicas, assim como a expressão e produção de citocinas pro-inflamatórias.
Em culturas de explantes de retina, o NPY inibiu as alterações na morfologia das
células da microglia, bem como o aumento da expressão de iNOS e a produção de ROS na microglia de retina, desencadeados pela exposição a LPS. Por outro lado, o NPY inibiu a
expressão e produção de IL-1β e IL-6. A ativação do Y1R mimetizou os efeitos do NPY na
inibição das alterações morfológicas e expressão de iNOS na microglia de retina induzidas
pelo LPS. Além disso, a ativação do Y1R inibiu a expressão e produção de todas as citocinas
pró-inflamatórias estudadas (TNF-α, IL-1β e IL-6), sugerindo um papel importante para o Y1R
nos efeitos mediados pelo NPY.
No modelo de I/R, a injeção intravítrea de NPY ou de LP-NPY antes da isquémia inibiu
as alterações morfológicas nas células da microglia de retina induzidas pela I/R após 24 h de
reperfusão. Além disso, após 8 h de reperfusão, o aumento na expressão de TNF-α, IL-1β e
IL-6 e na produção de TNF-α e IL-6 em retinas sujeitas a isquémia foi inibido pelo NPY.
No seu conjunto, os dados obtidos revelam que o NPY e a ativação do Y1R são
capazes de regular a ativação da microglia de retina e inibir a expressão e produção de
fatores neurotóxicos na retina. Estes resultados poderão contribuir para elucidar potenciais
efeitos fisiológicos e terapêuticos do NPY em processos neuroinflamatórios não somente na
retina, mas também no sistema nervoso
