Zielsetzung und Fragestellung:
Das Vorliegen knöcherner Defekte ist ein wesentliches klinisches Problem in zahlreichen chirurgischen Disziplinen. Das tissue engineering von Knochen stellt eine innovative Methode dar, welche die Möglichkeit eröffnet, ein Knochenersatzmaterial in theoretisch unbegrenzter Menge und vorbestimmbarer Form bei minimaler oder fehlender Hebedefektmorbidität zu gewinnen. Trotz dieses immensen Potenzials konnte sich das tissue engineering in klinisch relevanten Ausmaßen noch nicht durchsetzen. Ein wesentliches Problem wird in der bei zunehmender Größe der Leitschienen inhomogenen Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen vermutet. Bisher konnte dies jedoch quantitativ für das tissue engineering von Knochen nicht belegt werden. Folglich fehlen auch Strategien zur Überwindung dieses Problems nahezu gänzlich.
Das Ziel der vorliegenden Untersuchung bestand daher darin, die Sauerstoffkonzentration im Zentrum besiedelter Leitschienen zunächst unter statischen Bedingungen zu messen und zu überprüfen, ob es zu Auswirkung auf das Überleben der Zellen kommt. Anschließend sollten die Bedingungen mit Hilfe eines dynamischen Zellkultursystems optimiert und wiederum der Einfluss auf die zentrale Sauerstoffkonzentration und das Zellüberleben ermittelt werden.
Material und Methoden:
Zylindrische Leitschienen aus demineralisierter boviner Matrix (DBM) mit einem Durchmesser von 9 mm und einer Höhe von 5 mm wurden unter Verwendung einer standardisierten Methodik mit 50.000 murinen präosteoblastären Zellen (MC3T3) besiedelt und anschließend unter statischen und dynamischen Bedingungen kultiviert. Unter statischen Bedingungen erfolgte der Mediumwechel (Mem alpha) alle 48 Stunden, während unter dynamischen Bedingungen eine kontinuierliche Mediumzufuhr mit Hilfe einer Pumpe erfolgte. Als Standardperfusionsgeschwindigkeit wurde 18 µl/min verwendet. Weitere Versuche erfolgten mit drei- (54 µl/min) und fünffacher (90 µl/min) Perfusionsgeschwindigkeit.
Im Untersuchungszeitraum von sieben Tagen wurde die Sauerstoffkonzentration mit einer nadelartigen Sauerstoffsonde, die definiert ins geometrische Zentrum der Leitschiene appliziert wurde gemessen. Zusätzliche Messungen erfolgten unter statischen Bedingungen im umgebenden Medium, unter dynamischen Bedingungen im Mediumzu- und abfluss. Die Auswertung des Zellüberlebens und der Zellproliferation erfolgte mit Hilfe eines live-dead-assays sowie durch Zellzählung im Zentrum der Leitschiene.
Ergebnisse:
Unter statischen Zellkulturbedingungen kommt es im Zentrum der mit 50.000 Zellen besiedelten Leitschienen zu einem dramatischen Abfall der Sauerstoffkonzentration, wobei nach nur 5 Tagen die Sauerstoffkonzentration bei 0 % liegt. Konsekutiv kann im live-dead-assay ein ausgeprägtes Zellsterben, insbesondere im Zentrum der Leitschienen nachgewiesen werden. Hier konnten nach sieben Tagen keine überlebenden Zellen mehr beobachtet werden. Aus den Sauerstoffmessungen im umgebenden Medium sowie den Ergebnissen des live-dead-assay kann auf das Vorliegen eines deutlichen Sauerstoffgradienten von der Oberfläche zum Zentrum der besiedelten Leitschienen geschlossen werden. Diese Ergebnisse ließen sich bei Besiedlung mit 50.000 humanen SCP-Zellen bestätigen.
Unter Verwendung dynamischer Zellkulturbedingungen konnte der Abfall der zentralen Sauerstoffkonzentration deutlich vermindert und die Fläche unter der Sauerstoffkurve (AUC) signifikant (p < 0,01) vergrößert werden. Darüber hinaus konnte eine deutliche Verbesserung des Zellüberlebens beobachtet werden, insbesondere fielen signifikant (p < 0,01) mehr überlebende Zellen im Zentrum der Leitschiene auf. Dennoch kommt es im Beobachtungszeitraum zu einem deutlichen Abfall der Sauerstoffkonzentration im Zentrum der Leitschiene. Durch eine Steigerung der Perfusionsgeschwindigkeit auf das Drei- (54 µl/min) beziehungsweise Fünffache (90 µl/min) konnte nochmals eine deutliche Verbesserung der Sauerstoffversorgung und des Zellüberlebens, insbesondere in den kritischen zentralen Arealen der Leitschiene, erreicht werden.
Schlussfolgerungen:
Zentrale Hypoxie stellt einen wesentlichen limitierenden Faktor für das Leitschienen-basierte tissue engineering von Knochen in klinisch relevanten Dimensionen dar. Daher sollte im Rahmen der Kultivierung von dreidimensionalen Konstrukten ein adäquates Monitoring der Sauerstoffversorgung gewährleistet sein. In der Optimierung der Sauerstoffversorgung innerhalb von dreidimensionalen Konstrukten liegt ein entscheidender Schlüssel für die Verbesserung der klinischen Einsetzbarkeit des tissue engineering von Knochen
