Optimization of expression, purification and handling anti bacteria feature protein of bovine neutrophil B-defensing BNBD2

Abstract

زمینه و هدف: دیفنسین‎ها یکی از بزرگ‎ترین خانواده‎ی پپتید‎های ضد میکروب می‎باشند که به واسطه‎ی فعالیت بر علیه باکتری‎ها، قارچ‎ها و بسیاری از ویروس‎ها به عنوان آنتی‎بیوتیک‎های نسل جدید منفعت بسیاری دارند. هدف از این مطالعه بهینه سازی بیان، تخلیص و بررسی خاصیت ضد میکروبی پروتئین بتا دیفنسین 2 نوتروفیل‎های گاو (BNBD2) بوده است. روش بررسی: در این مطالعه‎ی تجربی-آزمایشگاهی باکتری اشرشیاکلی B‏L21(DE3) حامل وکتور pET-32a(+) که ژن BNBD2 در آن همسانه سازی شده بود جهت مطالعات مورد استفاده قرار گرفت. بیان پروتئین BNBD2 با تغییر در پارامترهای دانسیته‎ی سلولی، دمای رشد، مدت زمان القاء با استفاده از سیستم الکتروفورز عمودی (SDS-PAGE) و تست برادفورد به صورت کمی و کیفی بررسی گردید. مراحل تخلیص پروتئین نوترکیب با کمک روش شیمیایی شکافت در جایگاه فرمیک اسید و عبور از سانتریکون و اثر ضد باکتری پروتئین تخلیص شده بر چند نمونه‎ی باکتریایی گرم مثبت و گرم منفی مورد بررسی قرار گرفت. یافته ها: با استفاده از محیط کشت Luria–Bertani، شروع القاء در جذب نوری 8/0 در طول موج 600 نانومتر، غلظت یک میلی مولار ماده‎ی القاء کننده‎ی IPTG، دمای رشد 30 درجه و مدت زمان 4 ساعت پس از القاء بیشترین میزان بیان پروتئین به دست آمد. پروتئین نوترکیب با استفاده از شکافت در جایگاه فرمیک اسید و عبور از سانتریکون تخلیص گردید. نتایج آزمایش وسترن بلاتینگ نیز نشان داد که پروتئین نوترکیب به طور اختصاصی به آنتی‎بادی mouse anti-(His)6 peroxidase متصل می‎گردد. تشکیل هاله‎ی عدم رشد در محیط‎های کشت مولر هینتون آگار حاوی کشت سطحی باکتری های مورد آزمایش خاصیت ضد باکتری این پروتئین را نشان داد. نتیجه گیری: با توجه به خاصیت ضد میکروبی پروتئین BNBD2و امکان بیان پروتئین در باکتری E. coli می توان به تولید انبوه این پروتئین نوترکیب اقدام نمود