Gentransfer in primäre B-CLL-Zellen mittels EBV abgeleiteter Genvektoren

Abstract

Die chronische lymphatische Leukämie ist die häufigste Leukämie im Erwachsenenalter in den westlichen Ländern. Erkenntnisse der letzten Jahre haben das Spektrum verfügbarer Therapien deutlich erweitert, kurativ ist bisher nur die allogene Knochenmarkstransplantation. Im Blut der betroffenen Patienten treten die Zellen des malignen Klons in Kontakt mit autologen Immuneffektorzellen. Gentherapeutische Strategien basierend auf dem Transfer immunstimulatorischer Moleküle eröffnen deshalb neue Perspektiven für die Therapie der B-CLL. In der vorliegenden Arbeit wird erstmals die Eignung eines Helfervirus-freien EBV-Genvektorsystems für den Gentransfer in primäre B-CLL-Zellen beschrieben. Durch Optimierung der Vektorverpackung für ein eGFP kodierendes Plasmid konnte gezeigt werden, dass sich mit Hilfe einer Helfervirus-freien Verpackungszelline infektiöse Titer bis zu 2 x 106 infektiöse Partikel/ml generieren lassen. Das untersuchte Vektorsystem eignet sich für einen effizienten Gentransfer in primäre B-CLL-Zellen. Auf eine CD40L-Stimulation, wie sie zur Verbesserung der Transfereffizienz von Adenoviren zur Anwendung kommt, kann dabei verzichtet werden. Der Gentransfer lässt sich mit Hilfe eines monokonalen Antikörpers gegen CD21 weitgehend neutralisieren. In Kontrollexperimenten mit Überständen aus der Verpackung TR-deletierter Genvektorplasmide sinkt die Gentransferrate auf Werte nahe der Nachweisgrenze. Nach Verpackung des therapeutischen Moleküls CD40L sinkt die Transfereffizienz gegenüber dem eGFP kodierenden Genvektor und vermehrt unspezifische Effekte werden beobachtet. Zu den charakteristischen Eigenschaften EBV abgeleiteter Genvektoren zählen ein Tropismus für B-Lymphozyten und eine grosse Verpackungskapazität, die den Transfer von Gensequenzen bis zu einer Grösse von 160 kb erlaubt. Als essentielle EBV-Elemente enthalten die Genvektoren nur die Verpackungssignale TR und den lytischen Replikationsorigin oriLyt. Zukünfte Entwicklungen des Vektorsystems haben zum Ziel das Risiko von Rekombinationsereignissen zu reduzieren, die zur Freisetzung replikationsfähiger Virusmutanten oder potentiell onkogener viraler Gene führen könnten