石田 沙有里

石田, 沙有里

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Kwansei Gakuin University Repository

2015 年度修士論文要旨 海洋性珪藻の RubisCO 活性化酵素 CbbX の機能確認 関西学院大学大学院理工学研究科 生命科学専攻 松田研究室 石田沙有里  【研究目的】珪藻の葉緑体は紅藻に由来するが、核ゲノムには、紅藻由来の遺伝子に加え、多数の緑藻 由来の遺伝子および動物特異的と考えられている多くの遺伝子ホモログ持つ。そのため、最初に緑藻が 従属真核栄養生物に二次共生し、続いて紅藻が共生して緑藻型葉緑体を駆逐することによって珪藻が誕 生したと考えられている。CO2 固定酵素である ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RubisCO) は、基質とは別の CO2   分子が活性部位のリシン残基をカルバミル化し、そこに Mg2+が結合することで 酵素活性を発揮する。しかし、活性化前の RubisCO とその基質である ribulose-1,5-bisphosphate (RuBP)  が 結合するとカルバミル化が阻害され、不活性型 RubisCO となる。高等植物では、RuBP と結合した不活 性型 RubisCO  は、ATPases Associated with diverse cellular Activities plus (AAA＋ )ファミリーに属する RubisCO activase (Rca) により RuBP の解離が促進され、再活性化が可能となる。しかし、紅藻や珪藻に は高等植物が持つ Rca 遺伝子ホモログは存在せず、これらの藻類における RubisCO 活性化の機構は不明 であった。近年、紅色非硫黄細菌型 AAA＋ファミリータンパク質である CbbX が、紅藻型 Rca であるこ とが報告された。当研究室の先行研究より、海洋性珪藻 Phaeodactylum tricornutum の葉緑体コード cbbX (ptbbXc )及び核コード cbbX (ptcbbXn)が単離され、これらの PtCbbX が in vitro において RubisCO を活性 化することが確認された。本研究では、これら PtCbbX の詳細な機能確認を目的とする。   【実験方法】PtCbbXc/n の RubisCO 活性化能の評価：葉緑体移行シグナルを除去した ptcbbXn を発現用 ベクターpET-50b に挿入したコンストラクトを大腸菌 BL21(DE3) で発現、及び His-Tag アフィニティ ーカラムによる精製を行った。HRV 3C protease による複合タグの切断を行った後、RubisCO 活性化 能の評価を行った。pET28a に導入した PtCbbXc についても同様にアフィニティー精製を行い、 RubisCO 活性化能の評価を行った。野生型 P. tricornutum の細胞破砕液を硫安分画後、DEAE セファ ロースによる陰イオン交換クロマトグラフィーにより分画し、RubisCO の部分精製を行った。部分精製 RubisCO、リコンビナント PtCbbXc/n を用いて、in vitro において RubisCO 活性化能の有無を確認し た。RNA 干渉法(RNAi)による PtCbbXn の RubisCO 活性化状態と光合成への影響の確認：PtCbbXn を条 件選択的にノックダウンするために、硝酸イオン存在下で RNAi による発現抑制がかかる株を作成した。 硝酸イオン存在下で培養した野性株および PtCbbXn  の RNAi 株において RubisCO 活性を測定し、 PtCbbXn の発現抑制が RubisCO 活性化へ与える影響を評価した。光合成への影響：野生株および RNAi 株を Air(0.04% CO2)及び 1%CO2 環境下で生育させ、酸素電極により HCO3-に対する親和性（K0.5[HCO3-]） および最大光合成活性（Pmax）の測定を行った。   【実験結果と考察】精製 PtCbbXs の RubisCO 活性化能の評価： PtCbbXc/n 共に in vitro で RubiusCO を活性化することが確認できた。両者を単独で加えても、混合して加えても、RubisCO 活性化能に変化 はみられなかった。RNAi 形質転換体の RubisCO 活性化状態と光合成への影響の確認：RNAi 株は、野 生株と比べ RubisCO 活性が低かった。この結果より PtCbbXn は生理的に重要な役割を持つことが示 唆された。光合成速度測定において RNAi 形質転換体は Air 環境下で生育させた際、野生株と比べ最大 光合成活性が低下する傾向が見られた。1% CO2 下においても野生株と比べ最大光合成活性が低下し、 また、無機炭素に対する親和性が増加する傾向がみられた。このことから、PtCbbXn は細胞内で炭酸固 定活性化に寄与していることが示された。 

海洋性珪藻のRubisCO活性化酵素CbbXの機能確認

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