[Resumen]: Las enzimas termoestables presentan gran importancia debido a las características que les
confieren mayor estabilidad y actividad ante condiciones extremas. Por otra banda, las
enzimas con actividad lipolítica presentan una gran capacidad y alcance en la industria
biotecnológica, pues están siendo usadas en un amplio abanico de industrias, como la
alimentaria, la del papel, la de los detergentes, etc. De ahí que suscite gran interés la
bioprospección de estas enzimas en metagenotecas procedentes de aguas termales, ya
que su gran capacidad de acción en dichas condiciones facilita su posterior uso en la
industria. En el trabajo que se expone a continuación, se partió de una metagenoteca de
ADN del microbioma de aguas termales procedente de Muíño da Veiga (Ourense) en una
cepa de Escherichia coli con los objetivos de aislar un clon con actividad lipolítica,
caracterizar la enzima obtenida y secuenciar dicho ADN. Partiendo de 9 candidatos
iniciales, de los cuales se comprobó previamente su actividad en tributirina, trabajamos con
el que menos problemas nos presentaba a la hora de replicar los experimentos aquí
descritos. Dicho candidato produjo halo de actividad frente a la tributirina en placas con
medio LB, lo que confirmó como positivo en dicha actividad. Posteriormente procedimos a
caracterizar nuestra enzima, realizando ensayos de actividad lipolítica en los cuales usamos
laurato, octanoato y estearato como sustratos de la reacción. Solo mostró actividad con
laurato, con el cual pudimos deducir que presenta un óptimo de actividad a la temperatura
de 90ºC. Finalmente se realizó la secuenciación del ADN insertado y, a partir de los
resultados obtenidos del alineamiento realizado con Blastn, pudimos deducir que se trata
de un organismo perteneciente al mismo género que Conexibacter woesei, pero no a la
misma especie.[Resumo]: As enzimas termoestables presentan unha gran importancia debido ás características que
lles confiren maior estabilidade e actividade ante condicións extremas. Por outra banda, as
enzimas con actividade lipolítica presentan unha gran capacidade e alcance na industria
biotecnolóxica, pois úsanse nun amplo abanico de industrias, como a alimentaria, a de
papel, a de deterexentes, etc. De aí que suscite gran interese a bioprospección destas
enzimas en metaxenotecas procedentes de aguas termais, xa que a súa gran capacidade
de acción en ditas condicións facilita o seu posterior uso na industria. No traballo que se
expón a continuación, partiuse dunha metaxenoteca de ADN do microbioma de augas
termais procedente de Muíño da Veiga (Ourense) nunha cepa de Escherichia coli cos
obxectivos de illar un clon con actividade lipolítica, caracterizar a enzima obtida e
secuenciar dito ADN. Partindo de 9 candidatos iniciais, dos que se comprobou previamente
a súa actividade en tributirina, traballamos có que menos problemas nos presentaba á hora
de replicar os experimentos aquí descritos. Dito candidato mostrou halo de actividade fronte
á tributirina nas placas con medio LB, o que confirmou como positivo en dita actividade.
Posteriormente procedemos a caracterizar a nosa enzima, realizando ensaios de actividade
lipolítica nos que usamos laurato, octanoato e estearato como substratos da reacción. Só
presentou actividade co laurato, co cal poidemos deducir que presenta un óptimo de
actividade a unha temperatura de 90ºC. Finalmente, realizouse a secuenciación do ADN
insertado e, a partir dos resultados obtidos no aliñamento realizado co Blastn, poidemos
deducir que se trata dun organismo pertencente ao mesmo xénero que Conexibacter
woesei, pero non á mesma especie.[Abstract]: Thermostable enzymes show an enormous importance due to the characteristics, that
confer them more stability and also more activity against extreme conditions. Moreover, the
enzymes with lipolytic activity have a high capacity and reach in the biotechnological
industry, being used in a wide range of industries, such as the food-processing industry, the
paper industry, the detergent industry and so on. Hence, it arises interest the bioprospecting
of these enzymes in metagenomics libraries from thermal waters, since their great capacity
of action in these conditions makes easier their later use in the industry. In this assignment,
which is going to be exposed above, we departed from a metagenomics library of DNA from
the microbiome of thermal waters from Muíño da Veiga (Ourense) transformed into a strain
of Escherichia coli. Starting from 9 initial candidates, whose activity on tributyrin was
previously checked, we worked with the one that gave us the least problems to replicate the
experiments that are described here. This candidate produced an halo of activity against
tributyrin in plaques with LB medium, which finally confirmed its positive activity. Later, we
proceeded in order to characterize our enzyme, performing lipolityc activity assays. In this
assays we used laurate, octanoate and estearate as substrates. It only showed activity on
laurate with which we could deduce that it shows an optimum of activity at the temperature
of 90ºC (194ºF).
Finally, we performed the inserted DNA sequencing and, regarding to the results that we
obtained from the alignment done with Blastn, we could deduce that it is an organism
belonging to the same gender that Conexibacter woesei but a different species.Traballo fin de grao (UDC.CIE). Bioloxía. Curso 2017/201
