3- Dimensional characterization of PanIN (Pancreatic Intraepithelial neoplasia) in cleared human pancreatic cancer tissues by multiplex immunofluorescence

Abstract

O adenocarcinoma pancreático (PDAC) é uma das neoplasias com maior taxa de mortalidade devido à ausência de métodos de deteção precoce e terapêuticas eficazes, levando à sua deteção numa fase avançada e não-tratável da doença. A sua carcinogénese é explicada através da acumulação de alterações moleculares, numa das três lesões percursoras, neoplasia cística mucinosa, neoplasia intraductal papilar mucinosa e neoplasia intraepitelial pancreatica (PanIN). A PanIN é a lesão percursora mais frequente, caracterizada como uma proliferação epitelial não invasiva, que apresenta vários graus de displasia histológica, refletindo as alterações moleculares existentes nas diferentes fases, afetando os genes K-RAS, P16, TP53, SMAD4, entre outros. A histologia é o gold standard para o estudo de amostras, seus componentes e relação anatómica, através do corte das amostras em fatias finas, fornecendo apenas uma perspetiva bidimensional da amostra, que é limitante e que enviesa a perceção e o estudo da tridimensionalidade dos tecidos, em condições normais e patológicas. De forma a permitir o estudo tridimensional das amostras e evitar os artefactos dados pela reconstituição sequencial de fatias finas têm sido desenvolvidas as técnicas de clearing, que através da redução da opacidade dos tecidos, pela homogeneização dos índices refrativos dos vários constituintes celulares, reduzem a dispersão da luz e permitem a sua penetração. Várias são as técnicas até agora descritas, que se agrupam, consoante o reagente usado, em aquosas ou solventes orgânicos, sendo este último grupo mais eficaz em tecidos fibróticos, como os tecidos cancerígenos. Para a caracterização dos tecidos humanos são necessárias técnicas de imunofluorescência, no entanto a penetração máxima dos anticorpos, até agora descrita para blocos de parafina com PDAC, é de 0.6 mm, devido ao seu elevado conteúdo fibrótico. O presente trabalho teve como objetivo a otimização das técnicas de imunofluorescência aplicadas a tecidos espessos com PDAC, assim como, o estudo da relação anatómica entre os vários graus de PanIN e o PDAC. Para isso foram utilizados cinco blocos de parafina do arquivo do Centro Clínico da Fundação Champalimaud, com 2 mm de espessura, corados através de imunofluorescência com anticorpos anti-citoqueratina 19, anti-AGR2 e anti-p53. A otimização das técnicas de imunofluorescência, aplicadas a amostras espessas, foi feita através da introdução de um passo de recuperação antigénica, digestão enzimática e extensão do tempo de incubação do anticorpo, assim como, um aumento da quantidade de anticorpo por amostra, o que permitiu a visualização das amostras em toda a sua extensão. Todas as marcações citoplasmáticas foram desenvolvidas com êxito, no entanto não foi possível identificar marcação nuclear. Através da análise das amostras branqueadas, coradas com anticorpos anti-citoqueratina 19 e anti-AGR2, foi possível identificar ductos normais, ductos com PanIN e células cancerígenas, no entanto, trabalho adicional é necessário para estabelecer parâmetros de correlação das características apresentadas pelos ductos com PanIN, em amostras branqueadas espessas, com a classificação histológica. A nível anatómico, identifica-se uma tendência para as células cancerígenas se desenvolverem e localizarem junto das ramificações ductais e não perto dos ductos de maior calibrePancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the deathliest types of solid cancer mainly due to the lack of early detection techniques and therapeutic options, which makes its diagnosis and detection usually in advanced and untreatable stage of the disease. Currently it is accepted that its carcinogenesis is based on the accumulation of molecular changes in three precursor lesions, namely mucinous cystic neoplasm, intraductal papillary mucinous neoplasm and pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN). PanIN is the most common precursor of PDAC and it is characterized as a non-invasive epithelial proliferation in pancreatic ducts, with different degrees of cytological and morphological atypia that reflects a molecular transformation with mutations on K-RAS, P16, TP53 and SMAD4 genes at different stages. Histology is the gold standard technique for studying tissue specimens, their components and anatomical relationship, which by producing thin sections of tissues, allows a bidimensional analysis that limits and biases the correct tridimensional perspective of normal and pathological situations. To overcome the limitations presented by the analysis of thin sections, clearing techniques have been developed with the goal to reduce tissue’s opacity through the homogenization of refractive indexes within a cell and surroundings, which reduces light scattering and allows its penetration deep in the tissue. Several clearing techniques have been described so far, that can be divided, according to the type of reagent, in solvent-based and aqueous clearing techniques, being the first group more effective with fibrotic tissue, such as tumour samples. Immunofluorescence techniques are necessary to study human samples, but up until now the maximum penetration of an antibody described in the literature in human paraffin-blocks with PDAC is 0.6 mm, due to the high fibrotic content. The present work seeks to optimize deep-antibody immunolabelling of thick samples with PDAC and study the anatomical relationship between different grades-PanIN and PDAC. In order to do that, five archival formalin-fixed paraffin-embedded blocks from Champalimaud Clinical Centre were used and stained with anti-cytokeratin 19, anti-AGR2 and anti-p53 antibodies. The optimization of the immunolabelling was achieved through the application of an antigen retrieval step, enzymatic digestion and an increase of incubation time and amount of antibody, which allowed the visualization of the sample in all its extension. All the cytoplasmic stainings were successful but we were not effective with the nuclear staining. Through the analysis of cleared samples, stained with anti-cytokeratin 19 and anti-AGR2 antibodies, we could identify normal pancreas, PanIN and PDAC. Nevertheless, additional work has to be done to stablish a correlation between the features presented by the ducts of cleared thick samples and the histological grade. Anatomically there’s a tendency for cancer cells to develop and deposit next to ductal terminations and not close to ducts with big caliber