Antallet af komplekst bundne fosfatgrupper til fytinsyre i korn til foder og brødfremstilling er afgørende for biotilgængeligheden af mineraler. 31P NMR kombineret med multivariat data analyse er en unik metode at undersøge fytinsyrenedbrydningen på

Engelsen, Søren Balling

Nielsen, Merete Møller

Viereck, Nanna

Danish

Organic Eprints

26 dansk kemi, 87, nr. 11, 2006Fytinsyre (myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis dihydrogen fosfat, IP6), som er vist i figur 1, danner stærke komplekser med for-skellige divalente og trivalente kationer, men også til proteiner og stivelse. Oplø-seligheden af disse komplekser er meget pH-afhængig, og de fleste fytinsyre-mine-ral-komplekser, kaldet fytat, er opløselige ved pH under 3,5. Mel-lem pH 4 og 7, hvilket er samme pH som i tarmene, hvor absorp-tionen af mineralerne forekommer, er kom-pleksdannelsen nær uopløselig.Kompleksdannelsen er afhængig af antallet af fosfatgrupper på inositol-ringen; jo færre fosfatgrupper, des svagere komplekser. Fosfat i form af fytat er generelt ikke biotilgængelig for ikke-drøvtyggende dyr, fordi de mangler fordøjelsesenzymet fytase, som er nødvendigt for at nedbryde molekylet. Fytase er et enzym, der katalyserer den trinvise nedbrydning af fytinsyre til lavere inositol-fosfater (myo-inositol pentafosfat, IP5 til myo-inositol og uorganisk fosfat, figur 2). Der er to internationalt klassificerede fytaser: 3-fytase (EC 3.1.3.8) og 6-fytase (EC 3.1.3.26). Enzymerne er navngivet efter, hvilket C-atom første fosfatgruppe fraspaltes. 3-fytase synes at være af mikrobiel oprindelse, hvorimod 6-fytase synte-tiseres af planter [1]. En 4-fytase menes at stamme fra korn [2]. Enzymatisk aktivitet af fytase medvirker til frigivelse af fosfat og er en vigtig parameter for at gøre fytatrige fødevarer og foderstoffer ernæringsmæssigt gode. I et moderne landbrug med ikke-drøvtyggende dyrehold såsom svine- og kyllingefarme er foderet hovedsagelig soyabønner og majs. Fordi fytat i disse korn er bioutilgængelig, passerer fytatmolekylerne uabsorberet gennem tarmsystemet og direkte ud i miljøet og kan dermed medvirke til fosfatforurening. Ifølge litteraturen bør fytat være nedbrudt til mindst IP3, før de kompleksbundne mineraler Fytinsyrenedbrydning ved fytase – studeret med 31P NMR og multivariat kurveopløsningAntallet af komplekst bundne fosfatgrupper til fytinsyre i korn til foder og brødfremstilling er afgørende for biotilgængeligheden af mineraler. 31P NMR kombineret med multivariat dataanalyse er en unik metode til at undersøge fytinsyrenedbrydningAf Merete Møller Nielsen, Nanna Viereck & Søren Balling Engelsen, Kvalitet & Teknologi, Institut for Fødevarevidenskab, KVLfrigives og dermed bliver biotilgængelige [3]. Kombinationen fosfor-NMR og kemometri giver nogle unikke muligheder for at studere denne omdannelse.Hvorfor 31P NMR?Fytatnedbrydning i fødevarer studeres oftest ved HPLC, hvor det er muligt ved brug af et fytathydrolysat at identificere de forekommende nedbrydningsprodukter. HPLC er en destruktiv analyse, hvor det er nødvendigt at lave en syrehydrolyse på prøven for at få et ekstrakt, der kan anvendes i HPLC’en.På Institut for Fødevarevidenskab er vi i gang med at opbygge en NMR-facilitet specifikt beregnet til at studere en række udvalgte problemstillinger inden for fødevareforskningen vha. NMR-spektroskopi og samtidig udvikle dataanalyseprogrammel specifikt til kvantitativ NMR-signalbehandling. Med direkte inspiration fra metabonomics har vi introdu-ceret begrebet bromatonomics, der dækker over »kvantitative målinger af levnedsmidlers funktionelle kvalitetsparametre, studeret ved NMR på intakte fødevarer evalueret med multiva-riat dataanalyse«. Pga. den høje følsomhed har vi hovedsageligt interesseret os for proton NMR, men fosforkernen er faktisk den næstmest NMR-aktive kerne. Da 31P NMR samtidig er en yderst direkte måde at studere detaljeret fytatnedbrydning på, var det naturligt at undersøge det kvantitative potentiale for teknikken.Hvorfor multivariat dataanalyse?For at forstærke fortolkningen af den kvantitative information, der fremkommer ved måling på komplekse fødevaresystemer, er det ofte nødvendigt at kombinere de spektroskopiske målemeto-der med avancerede multivariate (kemometriske) metoder. Dette åbner for et hidtil uudnyttet potentiale for intern kvalitetskontrol af fødevarer, da disse teknologier tilsammen kan benyttes til fingerprinting af processer og produkter. Kemometri, kalder vi »matematik uden tårer«, fordi teknologien muliggør effektiv håndtering af store datasæt, hvor man udnytter den af statisti-kerne frygtede ko-linearitet, og hvor man projicerer sine data ind i et lavdimensionalt rum, der intuitivt kan visualiseres i et grafisk interface. Multivariat datavisualisering af komplekse multivariate datasæt fra den virkelige verden er måske den mest betydende feature ved kemometri. Sat lidt på spidsen findes der ingen univariate problemer i den verden, der omgiver os – dette er mest definitivt blevet understreget af den konservative ameri-kanske Food and Drug Administration i deres Process Analyti-cal Technology (PAT) guidance to the Pharmaceutical Industry: »Traditional one-factor-at-a-time experiments do not effectively address interactions between products and process variables«.En af fordelene ved at anvende kemometri på kollinære spek-Figur 2. Trinvis nedbrydning af fytinsyre (IP6) til lavere inositol-fosfater (IP5, IP4, IP3, IP2, IP1) og myo-inositol samt uorganisk fosfat.Figur 1. Atomstruktur af fytinsyre. Kun fosfat-gruppen på C-atom 2 er aksial.LEVNEdSMIddELKEMIIP6  →  IP5  →  IP4  →  IP3  →  IP2  →  IP1  →  myo-inositol + Pi27 dansk kemi, 87, nr. 11, 2006trale data er muligheden for at foretage en induktiv og eksplora-tiv undersøgelse [4]. Vi vil her demonstrere en sammenlignende applikation af to forskellige multivariate teknikker: den uni-verselle kemometriske algoritme principal komponent analyse (PCA) [5] og multivariat kurveopløsning (MCR) [6]. Fælles for de to algoritmer er, at de begge kræver en todimensional datastrategi, altså at der måles en serie af prøver, og at der som resultat findes fælles (latente) datastrukturer med tilhørende in-dividuelle scorer (koncentrationer). Der kræves altså en matrix X, hvor hver række repræsenterer måling (NMR-spektre) af en prøve (fytatprøve). Ved PCA er modellen, der ønskes løst, X = T*Pt + E, hvor datamatricen X (prøver × spektrale variable) opløses i en lavdimensional scorematrix (T) (prøver × antal latente kom-ponenter), der repræsenterer prøvekoncentrationer og en lavdimensional loading matrice (P) (spektrale variable × antal latente komponenter), som repræsenterer fælles latente spektra. E-matricen indeholder de usystematiske residualer. For robust opløsning af latente strukturer benytter PCA, at loadings (og scores) er ortogonale. PCA kan betragtes som det første bud ved eksplorativ dataanalyse pga. dens ekstraordinært robuste datareduktion, dens lave niveau af a priori forudsætninger og pga. dens datapræsentations-kapacitet.Multivariat kurveopløsning (MCR) [6] eller alternerende regression løser den samme model som PCA, men kræver ikke ortogonalitet ved løsningen. Analogt med PCA er modellen, der ønskes løst X = C*St + E, hvor datamatricen X (prøver × spektrale variable) ønskes kurveopløst i to matricer: C (prø-ver × antal rene komponenter) der indeholder de estimerede koncentrationer af de individuelle blandingskomponenter og S (spektrale variable × antal rene komponenter), der indeholder de rene spektra af blandingskomponenterne. MCR bygger på alternerende regression og er normalt ikke, som PCA, en robust datateknologi. I dette modelforsøg har vi implementeret MCR med non-negativity constraints [7] for både koncentrationer og spektra. Kemometriske beregninger og visualisering af spektre er fortaget med version 1.05beta af LatentiX (www.latentix.com, København, DK). MCR-beregninger er foretaget med CARS (www.kvl.models.dk) implementeret under MatLab (Math-Works Inc., Natic, USA).Nedbrydningsmønstret af fytinsyre målt med 31P NMRNedbrydningen af fytinsyre med fytase blev studeret i real-tid med 31P NMR-spektre. Figur 3 viser NMR-spektrene som funktion af tiden. Til at begynde med, inden fytase er aktivt, fremkommer der fire 31P-toppe i spektret (0.14, 0.47, 1.06 og 1.76 ppm) med et intensitets-forhold på 1:2:2:1. Dette forhold skyldes de seks fosfor-atomer i fytinsyremolekylet (IP6), hvoraf 2 par er degenereret pga. symmetri [8]. Efter aktiverin-gen af fytase ændres det spektrale mønster og intensitet som en konsekvens af nedbrydningen af IP6 til lavere inositoler. Først dannes fem nye toppe, som skyldes dannelsen af en specifik IP5, fordi der kun dannes fem lige stærke bånd. Dette skyldes dannelsen af et asymmetrisk molekyle, hvor kulstof 2 og 5 stadig er fosforyleret, i god overensstemmelse med, at det er en hvede-fytase, der anvendes, som er specifik for hydrolyse på kulstof 6. Den enzymatiske proces bliver mere og mere kompleks, men der dannes en dominerende isomer for penta-, tetra-, tri-, di- og monofosfater, hvilket tydeligt fremgår af figur 5, side 28. Nedbrydningen med fytase fortsatte i 14 timer og endepunktet var er spektrum med fire toppe (0.38, 0.42, LEVNEdSMIddELKEMIsKunstner Bjørn BjørnholtBeskyt din investering i forskning og udviklingKan du tjene penge på patenter?Patenterer dine internationale konkurrenter i dit marked?Kan du sælge et produkt uden at skulle bekymre dig om konkurrence?Ring til os for et uforpligtende møde. Vi synes det er sjovt at gøre vores kunder rige.KontaktPeter Horn Møller, tlf. 3363 9328, e-mail phm@pv.euPatentkonsulent og leder af Life Science & ChemistryPlougmann & Vingtoft er blandt Europas førende rådgivningsvirksomheder inden for patenter, designs og andre intellectual property rights. Vores 40 konsulenter har spidskompetencer inden for områderne Life Science & Chemistry samt Technology & Software.Læs mere på www.pv.eu28 dansk kemi, 87, nr. 11, 20062.45 og 2.77 ppm). De fire tilbageværende toppe korresponde-rer til de tre isomerer af IP1, der dannes ved hydrolysen, samt uorganisk fosfat (0.38 ppm). For at illustrere ændringerne i 31P-spektrene over tid er området fra 0.37 til 0.53 ppm fremhævet. På figuren ses, at tre toppe falder i intensitet (inkl. IP6 ved 0.47 ppm), mens en top stiger i intensitet. Dette mønster fortsætter, da IP5 nedbrydes til IP4 og IP4 til IP3 og så videre, indtil der kun er IP1 og uorganisk fosfat tilbage. En PCA over tidsserien fra 31P-spektrene afslører, at de to første principalkomponenter inkluderer i alt 94% af den totale variation i de spektrale data. Scoreplottet, som ikke er vist, har en for mean-centrerede data typisk hesteskoform og forekom-mer relativt simpelt. Denne simpelhed kunne ikke forudsiges ud fra den relativt komplekse reaktionsmekanisme fra IP6 til IP1. Men allerede hvis man inkluderer en tredje PC til et 3D score-plot (se figur 4) observeres et langt mere komplekst reaktions-mønster. Den ekstra 3% variation beskrevet ved PC3 resulterer i et loop-mønster af scoreværdierne, hvilket indikerer et meget kompleks scoremønster. I stedet for at modellere fytionsyrenedbrydningen i 31P NMR-spektrene med PCA opnås måske en mere realistisk model ved brug af multivariat kurveopløsning (MCR), der ikke kræver ortogonalitet af de rene spektre. Figur 5 viser resultatet af en seks-komponent MCR-analyse af 31P NMR-tidsserien af fytinsyrenedbrydningen.Med denne tidsserie af velopløste NMR-data viste MCR-metoden sig overordentlig reproducerbar, bl.a. uafhængigt af begyndelsesgæt af S. Modellen med seks rene komponenter resulterede i den bedste beskrivelse af variansen i NMR-spektrene. En fem-komponent model beskrev betydeligt mindre varians og en syv-komponent mo-del begyndte at dele tydelige enkeltkom-ponenter. Figur 5B viser den resulte-rende seks-kompo-nent MCR-model for fytatserien. De seks rene spek-tre af enkeltkompo-nenter bestemt ud fra tidsserien af fytasere-aktionerne ved brug af MCR er vist i figur 5A. Den lyseblå linje viser de fire toppe ved ppm 0.14, 0.47, 1.06 og 1.76 og re-præsenterer IP6. IP5 er repræsenteret af fem toppe ved 0.30, 0.38, 0.48, 0.83, 1.32 og 1.37 ppm (blå linje). Fra da af bliver reaktionerne mere komplekse pga. de mange mulige konfigurationer af fytat. For IP4 dominerer tre toppe lokaliseret ved 1.68, 1.73 og 1.75 ppm, men mange små toppe eksisterer også i områderne omkring 1.4, 2.1 and 2.4 ppm. Disse mønstre er i god overensstemmelse med den meget sparsomme litteratur, der er omkring 31P NMR på rene fytat-modelsystemer [8,9]. Mht. IP3 og de andre lavere inositol-fosfater bliver det meget vanskeligt at separere toppene uden brug af kemometri. Ikke desto mindre gør MCR, som implementeret i programmet CARS, det muligt at separere alle rene komponenter i fytinsyreserien. Det måske vigtigste resultat er vist i figur 5B, som viser det komplette nedbrydningsmønster fra fytase ved brug af realtids multivariate eksperimentelle data. Ud fra figuren fremgår det tydeligt, at allerede efter 2,5 time er næsten al IP6 nedbrudt. Efter ca. 1,5 time når dannelse af IP5 sit maksimum og gen-nemgår i løbet af de næste 6 timer en nedbrydning til IP4, som når et maksimum efter 4 timer og er fuldstændigt nedbrudt efter 10 timer. Dette resultat viser, at det tager ca. 10 timer (ved den givne koncentration og pH) at nedbryde fytat til en form, hvor mineralkomplekserne ikke længere er så stærke, og derfor bør mineralerne være biotilgængelige for mennesker og dyr. IP3 har en levetid på omkring 10 timer, og for IP2 er den ca. 8 timer. IP1 dannes under hele hydrolysen, men stiger mest efter 10 ti-mer. Ses dette resultatet i forhold til rugbrødsfremstilling, så bør al IP6 således være nedbrudt til mindst IP4, da selve bagepro-cessen tager omkring 4 timer. Tilsættes der tilmed surdej, som har en procestid på ca. 12 timer, så bør IP6 ifølge disse resul-tater være nedbrudt. Undersøgelse af rugbrød bagt med surdej har da også vist, at mørkt rugbrød uden kerner ikke har IP6 og derfor tilgængelige mineraler til stede [10].Figur 5. (A) MCR-model af 31P NMR-spek-tre. Lyseblå=IP6, Blå=IP5, Lys lilla=IP4, Purple=IP3, Lyserød=IP2 og Pink=IP1. (B) Plot af den relative intensitet som en funktion af tiden. De samme farver er benyttet til iden-tifikationen af de forskellige inositol-fosfater som i (A).Figur 4. 3D PCA scoreplot af de mean-centrerede 31P spektre. PC1, PC2 og PC3 forklarer tilsammen 98% af variationen i NMR-spektrene.Figur 3. 31P NMR-spektre, der viser hydrolyse af ren Na-fytate med fytase i 19 timer.LEVNEdSMIddELKEMI29 dansk kemi, 87, nr. 11, 2006Konklusion31P NMR er en meget direkte og yderst informativ metode til at beskrive nedbrydelsen af fytinsyre til lavere inositol-fosfater ved brug af enzymet fytase. Brugen af kemometri og MCR gør det muligt at visualisere og forstærke fortolkningen af resulta-terne. Ved brug af LatentiX har det været muligt at visualisere den tidsafhængige hydrolyse af fytinsyre, mens modellering af spektrene med MCR (CARS) gjorde det muligt at identificere og kvantificere de forskellige stadier af fytat nedbrydningen til inositol og uorganisk fosfat. E-mail-adresseSøren Balling Engelsen: se@kvl.dkReferencer1.  Centeno,C., Viveros, A., Brenes, A., Canales, R., Lozano, A., and de la Cuadra, C. Effect of Several Germination Conditions on Total P, Phytate P, Phytase, and Acid Phosphatase Activities and Inositol Phosphate Esters in Rye and Barley. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 3208-32152.  Greiner,R., Alminger, M. L., and Carlsson, N.-G. Stereospecificity of myo-Inositol Hexakisphosphate Dephosphorylation by a Phytate-Degrad-ing Enzyme of Baker’s Yeast. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 2228-22333.  Brune,M., Rossander-Hultén, L., Hallberg, L., Gleerup, A., and Sandberg, A.-S. Iron Absorption from Bread in Humans: Inhibiting Effects of Cereal Fiber, Phytate and Inositol Phosphates with Different Numbers of Phos-phate Groups. J. Nutr. 1992, 122, 442-4494.  Munck,L., Norgaard, L., Engelsen, S. B., Bro, R., and Andersson, C. A. Chemometrics in food science - a demonstration of the feasibility of a highly exploratory, inductive evaluation strategy of fundamental scientific significance. Chemo. Intell. Lab. Syst. 1998, 44(1-2), 31-605.  Hotelling,H. Analysis of a complex of statistical variables into principal components. Journal of Educational Psychology 1933, 24, 417-4416.  Tauler,R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemo. Intell. Lab. Syst. 1995, 30(1), 133-1467.  Bro,R., and de Jong, S. A fast non-negativity-constrained least squares algorithm. Journal of Chemometrics 1997, 11, 393-4018.  Frølich,W., Drakenberg, T., and Asp, N. G. Enzymatic degradation of phytate (myo-inositol hexaphosphate) in whole grain, flour suspension and dough - a comparison between P-31 NMR spectroscopy and a ferric ion method. Journal of Cereal Science 1986, 4(4), 325-3349.  Kemme,P.A., Lommen, A., De Jonge, L. H., Van der Klis, J. D., Jong-bloed, A. W., Mroz, Z., and Beynen, A. C. Quantification of inositol phosphates using P-31 nuclear magnetic resonance spectroscopy in animal nutrition. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1999, 47(12), 5116-512110.  Nielsen,M.M., Damstrup, M. L., Thomsen, A. D., Rasmussen, S. K., and Hansen, Å. Phytase activity and degradation of phytic acid during rye bread making. Eur. Food. Res. Technol. 2006, in press.LEVNEdSMIddELKEMINyt om......zinkErnesto Carmona der er professor i kemi ved universitetet i Sevilla, har fremstillet den første molekylforbindelse, der indeholder en zink-zink-binding.Carmona har sammen med kemistuderende Irena Resa fremstillet:Zn(C5Me5)2hvor Me er en methylgruppe.Dette stof blev blandet med diethylzink, idet forskerne ønskede at fremstille:Zn(η5-C5Me)EtDe fik fremstillet noget af dette stof. Men ved en uventet sidereaktion blev der dannet et helt andet stof, der viste sig at være:Zn2(η5-C5Me5)2Altså med to zinkatomer: Zn-Znklemt sammen som i en sandwich. Stoffet kan beskrives ved navnet decamethyldizincocen.BosLitteratur: Ron Dagani 2004: Organo Metallic Chemistry. Chemical & Engineering News. 23. august 2004: 5Nyt om......titaniumhvidtTitanium er et relativt hyppigt forekommende grundstof: 0,6% af den os tilgængelige del af jorden er titanium. Tita-nium forekommer især som mineralerne ilmenit (jern(II)titanium(IV)trioxid) og rutil (titanium(IV)dioxid). Af disse mineraler udvindes rent titanium(IV)dioxid som et hvidt pulver, der er velegnet som farvestof.DuPont har nu indgået en aftale med kinesiske myndighe-der om at investere en milliard $ i en titaniumdioxidfabrik i Kina. DuPont er Verdens største producent af TiO2.   BosLitteratur: 28. november 2005 Chemical & Engineering News: 9

Fytinsyrenedbrydning ved fytase

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Organic Eprints