The post-infection activity of hydrated lime against conidia of Venturia inaequalis was evaluated using an in

vitro test system based on isolated apple leaf cuticles. Experiments were conducted at 20°C and treatments

were applied 24 or 48 h after inoculation. Experiments were assessed by counting living primary stromata 72

h after inoculation using fluorescence microscopy and fluorescein diacetate (FDA) as a vital stain. At the

conditions of the in vitro test system hydrated lime had a post-infection activity. Suspension of 5 g l-1 applied

24 h after inoculation (16 h after infection) killed all primary stromata and stopped their further development.

Treatments 48 h after inoculation reduced the number of vital primary stromata to 60% of control.

Treatments with saturated solutions of hydrated lime (pH 12.45) and with KOH solutions of different pH

showed that a pH higher than 12.4 was needed to be 100% effective. Suspensions of calcium carbonate

(6.75 g l-1) had no effect

Montag, Jurith

Schreiber, Lukas

Schönherr, Jörg

German

Organic Eprints

1 Universität Hannover, Institut für Biologische Produktionssysteme, Fachgebiet Obstbau,  Herrenhäuser Straße 2, D-30419 Hannover, E-Mail: jurith.montag@obst.uni-hannover.de 2 Universität Bonn, IZMB, Kirschallee 1, D-53115 Bonn The post-infection activity of hydrated lime against conidia of  Venturia inaequalis Die postinfektionelle Wirkung von Calciumhydroxid auf Konidien von  Venturia inaequalis Jurith Montag1, Lukas Schreiber2 and Jörg Schönherr1 Abstract The post-infection activity of hydrated lime against conidia of Venturia inaequalis was evaluated using an in vitro test system based on isolated apple leaf cuticles. Experiments were conducted at 20° C and treatments were applied 24 or 48 h after inoculation. Experiments were assessed by counting living primary stromata 72 h after inoculation using fluorescence microscopy and fluorescein diacetate (FDA) as a vital stain. At the conditions of the in vitro test system hydrated lime had a post-infection activity. Suspension of 5 g l-1 applied 24 h after inoculation (16 h after infection) killed all primary stromata and stopped their further development. Treatments  48  h  after  inoculation  reduced  the  number  of  vital  primary  stromata  to  60%  of  control. Treatments  with  saturated  solutions  of hydrated lime (pH 12.45) and with KOH solutions of different pH showed that a pH higher than 12.4 was needed to be 100% effective. Suspensions of calcium carbonate (6.75 g l-1) had no effect.   Keywords: Venturia inaequalis , Calciumhydroxid, Konidien, postinfektionelle Wirkung  Einleitung Venturia inaequalis, der Erreger des Apfelschorfes ist eine der weltweit wichtigsten Krankheiten im Apfelanbau  (MACHARDY  1996).  Im  integrierten  Apfelanbau  ermöglichen  moderne  synthetische Fungizide eine zuverlässige Schorfkontrolle. Im ökologischen Obstbau stehen hingegen lediglich Kupfer- und Schwefelpräparate zur Schorfkontrolle zur Verfügung (ANONYMUS 2000). Diese sind oft weniger  wirksam  und  zudem  phytotoxisch  (ELLIS  ET  AL.  1991,  MACHARDY  1996,  STENSVAND  UND AMUNDSEN  2000).  Kupfer  hat  zudem  ein  schlechtes  ökotoxikologisches  Profil,  das  in  einigen europäischen Ländern bereits zu einem Verbot geführt hat (HOLMSTRUP ET AL. 1998, PAOLETTI ET AL. 1998,  FRIIS  ET  AL.  2004).  Aus  diesen  Gründen  werden  große  Anstrengungen  unternommen alternative Bekämpfungsstrategien für den ökologischen Apfelanbau zu entwickeln. Calciumhydroxid (Ca(OH)2) war bereits Bestandteil der umfangreichen Studie von HAMILTON (1931). Er  beobachtete,  dass  die  Ausbringung  von  Calciumhydroxid  vor  erfolgter  Inokulation  nur  wenig effektiv war. Bei Sprüh-Applikationen 16 bzw. 90 Stunden nach Inokulation bei Temperaturen von 12 bzw. 16° C konnte die Anzahl der Läsionen gegenüb er der Kontrolle auf 27 bzw. 58 % reduziert werden.  Hamilton  kommentierte  die  Ergebnisse  folgendermaßen:  „Hydrated  or  stone  lime  3-50, applied as spray, …, may exhibit some fungicidal properties of their own under certain conditions.“  Erst  knapp  70  Jahre  später  wurde  in  Australien wieder ein Versuch unternommen Birnenschorf (Venturia pirinia Aderhold) mit Ca(OH)2 zu bekämpfen (WASHINGTON ET AL. 1998). Die protektiven Spritzungen konnten die Befallsrate zwar reduzieren, waren jedoch sehr viel weniger effektiv als Spritzungen mit konventionellen Vergleichsfungiziden. SCHULZE  UND  SCHÖNHERR  (2003)  beobachteten,  dass  eine  Behandlung  mit  einer  Ca(OH)2-Suspension  24  Stunden  nach  erfolgter  Inokulation  die  Konidien  und  Keimschläuche  von  V. inaequalis  schnell  abtötete  und  der  weitere  Keimverlauf  dadurch  gestoppt  wurde.  Erfolgte  die Behandlung jedoch vor erfolgter Inokulation hatte die Suspension keinen Effekt. Die Unwirksamkeit der Behandlung vor Inokulation erklärt sich dadurch, dass Ca(OH)2 durch die Reaktion mit dem CO2 Archived at http://orgprints.org/13797/  der  Luft  sehr  schnell  in  das  unwirksame  Calciumcarbonat  (CaCO3)  und  Calciumbicarbonat (Ca(HCO3)2) umgewandelt wird (RÖMPP 1995). Die Autoren stellten daher die Hypothese auf, dass die Wirksamkeit von Ca(OH)2 auf dem hohen pH-Wert von 12,45 beruht. Alle drei Studien stimmen jedenfalls darin überein, dass Ca(OH)2 als protektives Fungizid ungeeignet ist. Ziel der vorliegenden Studie war es, mit Hilfe eines in vitro Testsystems auf der Basis enzymatisch isolierter Kutikularmembranen zu ermitteln, ob Ca(OH)2 eine postinfektionelle Wirkung besitzt und welches Zeitfenster für die Applikation postinfektioneller Behandlungen zur Verfügung steht. Nach SZKOLNIK (1981) bezeichnet die postinfektionelle (kurative) Wirkung eines Fungizids die chemische Wirkung, die eine Weiterentwicklung des Pilzes nach erfolgter Infektion bzw. nach Abschluss einer Infektionsperiode  verhindert.  Als  Positivkontrolle  wurde  Schwefelkalk  eingesetzt,  dessen postinfektionelle Wirkung belegt ist (HAMILTON 1931). Außerdem sollte geklärt werden, welche Rolle der pH-Wert für die Wirksamkeit von Ca(OH)2 spielt.   Material und Methoden Für  die  Versuche  wurden  isolierte  Kutikularmembranen  (CM)  von  Malus ´ domestica  ‚Gloster’ verwendet.  Dazu  wurden  Blätter  (viertes  und  fünftes  voll  entfaltetes  Blatt)  von  Neutrieben  der genannten  Sorte  in  einer  Anlage  des  Versuchsbetriebes  der  Universität  Hannover  in  Ruthe gesammelt. Die Isolation erfolgte enzymatisch nach der Methode von SCHÖNHERR  UND RIEDERER (1986). Verwendet wurden nur die adaxialen astomatären CM. Als Inokulum wurden Konidien einer in vitro Kultur von V. inaequalis verwendet. Die Produktion der Konidien erfolgte auf Cellophanmembranen (PARKER ET AL. 1995). Die Sporendichte der Suspension wurde mittels eines Kolkwitz-Planktonzytometers unter dem Lichtmikroskop ermittelt (KOLLAR 1998) und auf den gewünschten Titer von ca. 1 ´ 104 Konidien ml-1 eingestellt.  Für die Versuche wurden Petrischalen mit 40 ml H2Odem. befüllt und die CM mit einer Pinzette auf die Wasseroberfläche gegeben. Die morphologische Außenseite musste dabei nach oben zeigen. Zur Inokulation wurde ein 5 µl Tropfen Konidiensuspension (» 50 Konidien 5 µl-1) in die Mitte der CM pipettiert. Nach erfolgter Inokulation wurden die Petrischalen mit ihrem Deckel und mit Parafilm verschlossen.  Die  Inkubation  erfolgte  für  die  jeweils  angegebene  Zeit  immer  bei  20° C  und  im Dunkeln. Für jede Behandlung eines Experiments wurden jeweils zehn CM in eine Petrischale gegeben, und es wurden zwei unabhängige Experimente durchgeführt. Jedes Experiment bestand somit aus 20 Beobachtungen  je  Behandlung.  Zu  jedem  Experiment  wurde  die  Keimrate  der  verwendeten Sporensuspension auf sechs CM in einer Petrischale ermittelt. Lag die ermittelte Keimrate in einem Experiment unter 80 %, so wurde dieses verworfen und das Experiment wiederholt.  Die  Behandlungen  erfolgten  24  bzw.  48  h  nach  Inokulation. Zunächst wurde die überschüssige Flüssigkeit des Inokulum-Tropfens mit einem Stück Krepppapier aufgesaugt. Danach wurden auf dieselbe Stelle 5 µl der jeweiligen Behandlungslösung pipettiert. Nach einer Inkubationszeit von 15 Minuten wurde überschüssiges Wasser und die darin gelösten Behandlungsrückstände mit einem Stück Krepppapier aufgesaugt. Auf dieselbe Stelle wurden wieder 5 µl H2Odem. pipettiert. Dieser Spülvorgang  wurde  dreimal  wiederholt.  Nach  so  erfolgter  Behandlung  wurden  die  Petrischalen verschlossen und für den Rest der Inkubationszeit in den Inkubator verbracht. Die Behandlungen erfolgten mit Ca(OH)2 in Form einer gesättigten Lösung (hergestellt mittels Vakuumfiltration) und einer Suspension (5 g l-1) sowie mit CaCO3 (6,75 g l-1), mit Schwefelkalk (1,5 %) und mit KOH-Lösungen verschiedener pH-Werte (11, 12, 12,4 und 12,6).  Die Effekte der postinfektionellen Behandlungen auf die Anzahl und die Vitalität primärer Stromata wurden unter Verwendung des Vitalfarbstoffes Fluoresceindiacetat (FDA) fluoreszenzmikroskopisch Archived at http://orgprints.org/13797/  ausgewertet (HAMEL ET AL. 1990, BREEUWER ET AL. 1995). Dabei wurde die Farbstofflösung nur an die  morphologische  Innenseite  der  CM  pipettiert,  auf  der  sich  die  Stromata  ausbildeten.  Nach 10minütiger Inkubationszeit unter Lichtausschluss konnte die Anzahl vitaler, grün fluoreszierender Stromata ausgezählt werden. Hatte eine Konidie mehr als ein Appressorium ausgebildet und die CM mehr als einmal penetriert, so wurde dies als ein Penetrationsereignis bzw. als ein Stroma gezählt.  Ergebnisse und Diskussion  Vitale primäre Stromata (% der 72 h-Kontrollel)02040608010012011,0 12,4 12,0 12,6 1,5 % ges. 6,75 g l-1 5 g l-1KOH (pH) CaCO3 Ca(OH)2 Schwefelkalka a c b a b c cAVitale primäre Stromata (% der 72 h-Kontrollel)02040608010012011,0 12,4 12,0 12,6 1,5 % ges. 6,75 g l-1 5 g l-1KOH (pH) CaCO3 Ca(OH)2 Schwefelkalka a c b a b c cAVitale primäre Stromata (% der 72 h-Kontrollel)02040608010012011,0 12,4 12,0 12,6 1,5 % ges. 6,75 g l-1 5 g l-1KOH (pH) CaCO3 Ca(OH)2 Schwefelkalka a c b a a d eBVitale primäre Stromata (% der 72 h-Kontrollel)02040608010012011,0 12,4 12,0 12,6 1,5 % ges. 6,75 g l-1 5 g l-1KOH (pH) CaCO3 Ca(OH)2 Schwefelkalka a c b a a d eB Abbildung  1:  Postinfektionelle  Wirkung  von  Ca(OH)2,  CaCO3,  KOH-Lösungen  verschiedener  pH-Werte sowie Schwefelkalk auf die Anzahl vitaler primärer Stromata. Die Behandlungen wurden 24 h (A) bzw. 48 h nach  Inokulation  (B)  appliziert  und  nach  15  min  wieder  abgespült.  Die  Anzahl  vitaler  primärer  Stromata wurde 72 h nach Inokulation unter Verwendung des Vitalfarbstoffes FDA ausgezählt. Die Ergebnisse zeigen die Prozentsätze vitaler primärer Stromata bezogen auf den Prozentsatz der 72 h-Kontrolle. Gruppen, die mit demselben Buchstaben gekennzeichnet sind, unterscheiden sich nicht signifikant voneinander (p < 0,05).  Als Suspension zeigte Calciumhydroxid eine deutliche postinfektionelle Wirkung. Bei Behandlungen 24 h nach Inokulation bzw. 16 h nach Abschluss einer Infektionsperiode (STENSVAND ET AL. 1997) tötete Ca(OH)2 (5 g l-1) alle vitalen primären Stromata (Abb. 1A). Die Wirkung war allerdings deutlich schlechter, wenn die Behandlung erst 40 Stunden nach Abschluss einer Infektionsperiode erfolgte (Abb. 1B). Schwefelkalk (1,5 %), der als Positivkontrolle diente, zeigte auch bei Applikationen 40 Stunden nach Abschluss einer Infektionsperiode eine sehr gute postinfektionelle Wirkung (Abb. 1).  Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass die Wirkung von Ca(OH)2 auf dem hohen pH-Wert der Suspension beruht. KOH-Lösungen bis pH 12 und eine CaCO3-Suspension mit pH 8,3 zeigten keine Wirkung (Abb. 1). Ein pH-Wert ³ 12,4 war nötig, um primäre Stromata zu töten bzw. um die Anzahl  vitaler  primärer  Stromata  gegenüber  den  unwirksamen  Behandlungen  signifikant  zu reduzieren (Abb. 1). Für die Schwefelkalk-Lösung, deren pH-Wert mit 11,2 ebenfalls sehr hoch war, wird ein Beitrag des pH-Wertes zur Wirkung ausgeschlossen (GOLDSWORTHY 1928).  SCHULZE  UND SCHÖNHERR (2003) zeigten, dass bei ausreichend hohem pH-Wert eine sehr kurze Inkubationszeit nötig ist, um alle Konidien zu töten. In der vorliegenden Arbeit reichte der Effekt der gesättigten  Ca(OH)2-Lösung  nicht  aus,  um  bei  einer  postinfektionellen  Applikation  alle  primären Stromata  abzutöten  (Abb.  1),  obwohl  der  Ausgangs-pH-Wert  bei  12,45  lag.  Die  Suspension hingegen reduzierte die Rate vitaler primärer Stromata auf Null. Anscheinend sank der pH-Wert der gesättigten  Lösung  durch  die  Reaktion  mit  dem  CO2  der  Luft  so  schnell  ab,  dass  einige  der primären  Stromata  überleben  konnten.  Die  Suspension  enthält  einen  Vorrat  an  ungelösten Archived at http://orgprints.org/13797/  Ca(OH)2-Partikeln, der den pH-Wert von 12,45 aufrechterhält, bis sich alle Partikel aufgelöst haben. Für die Bekämpfung des Apfelschorfes mit Ca(OH)2 bedeutet dies, dass Suspensionen, die einen Vorrat  an  Ca(OH)2-Partikeln  enthalten,  verwendet  werden  müssen  und  gesättigte  Lösungen ungeeignet sind. Die Löslichkeit von Ca(OH)2 wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst, liegt aber  für  gewöhnlich  im  Bereich  von  1,6  g  l-1  (JOHANNSEN  UND  RADEMACHER  1999).  Für  eine erfolgreiche Schorfkontrolle sollten daher mindestens 2 bis 2,5 g l-1 verwendet werden.  Bei  der  getesteten  Konzentration  kann  ausgeschlossen  werden,  dass  Ca2+-Ionen  oder  CaCO3-Partikel  zur  Wirkung  von  Ca(OH)2  beitrugen.  Bei  gleichem  Calciumgehalt  wie  die  Ca(OH)2-Suspension (5 g l-1), zeigte CaCO3 (6,75 g l-1) keinen Effekt auf die Anzahl vitaler primärer Stromata (Abb. 1). Dies bestätigt die Ergebnisse von SCHULZE UND SCHÖNHERR (2003), bei denen ebenfalls keine  Wirkung  auf  die  Vitalität  gekeimter  Konidien  nach  Applikationen  von  Calciumchlorid  und CaCO3  festgestellt werden konnten.  KOH-Lösungen erwiesen sich als sehr wirksam. Für einen Schorfbekämpfung in der Praxis sind sie aber nicht geeignet, da die erforderlichen Konzentrationen extrem hoch sind was sehr hohe Kosten verursachen und außerdem das Nährstoffgleichgewicht der Bäume zerstören würde. Für Ca(OH)2 wurden bislang keine phytotoxischen Reaktionen beobachtet. Der Grund dafür ist vermutlich, dass der pH-Wert sehr schnell absinkt und sich CaCO3 und Calciumbicarbonat bilden, die beide nicht phytotoxisch sind.  Literatur ANONYMUS: IFOAM Basic Standards for Organic Production and Processing. Tholey-Theley Press, New York, CT, 2000. BREEUWER, P.; DROCOURT, J. L.; BUNSCHOTEN, N.; ZWIETERING, M. H.; ROMBOUTS, F. M. UND ABEE, T. (1995): Characterization of uptake and hydrolysis of fluorescein diacetate and carboxyfluorescein diacetate by intracellular esterases in Saccharomyces cerevisiae, which result in accumulation of fluorescent product. Applied and Environmental Microbiology 61, 1614-1619. ELLIS,  M.  A.;  MADDEN,  L.  V.  UND  WILSON,  L.  L.  (1991):  Evaluations  of  organic  and  conventional fungicide programs for control of apple scab, 1990. Fugic. Nematicide Tets 46, 10.  FRIIS, K.; DAMGAARD, C. UND HOLMSTRUP, M. 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