Caracterização de polimorfismos no gene pol associados a resistência aos inibidores da protease utilizados em regimes terapêuticos de prevenção da transmissão mãe-filho do vírus da imunodeficiência humana tipo 1

Abstract

Segundo a UNAIDS (Joint United Nations Programme on HIV/AIDS), no final de 2014, o vírus da imunodeficiência humana (HIV) era responsável pela infecção de 36,9 milhões de pessoas, das quais, 2,6 milhões eram crianças com idade inferior a 15 anos. A transmissão vertical representa a principal causa de infecção em crianças e, embora o risco associado tenha diminuído drasticamente com a introdução da terapia anti-retroviral de alta eficácia, esta continua a verificar-se. Ainda que tenha sido alvo de progressos significativos, o acesso das mulheres grávidas à terapia ainda se mantém difícil em certas regiões do planeta. Em alguns casos, por outro lado, a presença de mutações virais associadas a resistência é responsável pela falha do regime profiláctico implementado e pode, consequentemente, levar à transmissão de vírus resistentes para o recém-nascido. Nos últimos anos, os inibidores da protease foram introduzidos nos regimes terapêuticos para prevenção da transmissão vertical, anteriormente constituídos somente por inibidores da transcriptase reversa. O presente estudo incidiu sobre um grupo de 34 mulheres multíparas infectadas com HIV-1, às quais foi efectuada a recolha de sangue periférico, num período máximo de dois dias após o parto, entre os anos de 1999 e 2008. Na sua grande maioria, as mulheres incluídas no estudo tinham cumprido regimes terapêuticos de prevenção da transmissão vertical do HIV-1 durante a gravidez. O DNA proviral das 70 amostras em estudo foi extraído a partir de células mononucleadas do sangue periférico, sendo efectuada a amplificação da região codificante da protease do gene pol, por nested PCR dupla. Após sequenciação nucleotídica, foi realizada a caracterização genotípica das estirpes virais por análise filogenética manual e a caracterização das mutações associadas a resistência, assim como, de outros polimorfismos genéticos, com recurso ao programa HIVdb, implementado através do Genotypic Resistance Interpretation Algorithm da Stanford University HIV Drug Resistance Database. Este estudo revelou uma elevada diversidade genética do HIV-1 na população em causa, na qual foram identificados os subtipos G (47,8%), C (14,9%) e B (11,9%) como predominantes, destacando-se ainda uma elevada prevalência de formas recombinantes únicas (16,4%). Os subtipos não-B foram responsáveis pela infecção em todas as mulheres de origem africana, sendo o subtipo B apenas encontrado em mulheres de naturalidade portuguesa. As mulheres africanas foram as únicas infectadas com o subtipo C. Relativamente à pesquisa de mutações associadas a resistência aos inibidores da protease, foram detectadas duas mutações principais (D30N e M46I) e sete mutações acessórias (L10I, L10V, L33F, G48E, A71T, A71V e T74S), em 19 das sequências estudadas. Destas, 16 eram de subtipos não-B, não sendo contudo demonstrada nenhuma associação estatisticamente significativa. Além disso, a maioria destas mutações foram detectadas em mulheres cujos regimes terapêuticos incluíam inibidores da protease, os quais podem ter levado à sua selecção. Dos restantes polimorfismos genéticos, não associados a resistência, a detecção foi superior em subtipos não-B, sendo alguns classificados como “assinaturas genéticas” de subtipo. A identificação de mutações associadas a resistência aos inibidores da protease em mulheres cujos regimes terapêuticos incluem estes fármacos pode ter implicações na prevenção da transmissão vertical, sendo importante a sua monitorização.According to the UNAIDS (The Joint United Nations Programme on HIV/AIDS), the human immunodeficiency virus (HIV) infected 36.9 million people at the end of 2014, of whom 2.6 million were children under 15 years of age. Vertical transmission is the main cause of infection in children and while the associated risk has decreased dramatically with the introduction of highly active antiretroviral therapy (HAART), this transmission continues to occur. Although it has been the subject of significant progress in recent years, the access of pregnant women to therapy still remains difficult in certain regions of the world. Moreover, in some cases, the presence of viral mutations associated with resistance is responsible for the failure of the implemented prophylactic regimens and may consequently lead to transmission of resistant viruses to newborns. Not long ago, protease inhibitors were introduced in therapeutic regimens for prevention of vertical transmission, formerly including reverse transcriptase inhibitors only. This study focused on a group of 34 multiparous women infected with HIV-1, from whom a sample of peripheral blood was collected within two days after delivery, between the years 1999 and 2008. The great majority of the women included in the study had followed therapeutic regimens for prevention of vertical transmission of HIV-1 during pregnancy. The proviral DNA of 70 samples analyzed was extracted and purified from peripheral blood mononuclear cells, being the amplification of the protease coding region in pol gene carried out by double nested PCR. After nucleotide sequencing, the genetic characterization of the viral strains by manual phylogenetic analysis was performed, along with the characterization of resistance-associated mutations, as well as other genetic polymorphisms, using the HIVdb program, implemented by the Genotypic Resistance Interpretation Algorithm from the Stanford University HIV Drug Resistance Database. The study revealed a high genetic diversity of HIV-1 within this population, in which G (47.8%), C (14.9%), and B (11.9%) subtypes were predominant, with also a high prevalence of unique recombinant forms (16.4%). Non-B subtypes were responsible for the infection in all women of African origin, and the B subtype was found only in women of Portuguese nationality. Additionally, African women were the only infected with subtype C. Considering the mutations associated with resistance to protease inhibitors, two major mutations (D30N and M46I) and seven minor mutations (L10I, L10V, L33F, G48E, A71T, A71V, and T74S) were identified, in 19 of the sequences studied. Of these, 16 were classified as non-B subtypes, but no statistically significant association was found. Furthermore, most of these mutations were detected in women whose prophylactic regimens included protease inhibitors, which may have led to their selection. The remaining genetic polymorphisms, not associated with anti-retroviral resistance, were mainly detected in non-B subtypes, with some being classified as subtype "signatures". The identification of HIV-1 mutations associated with resistance to protease inhibitors in women whose prophylactic regimens during pregnancy included this class of drugs may have implications for the prevention of vertical transmission of the virus, stressing the importance of mutation surveillance