O conceito “One health” reconhece a necessidade do trabalho conjunto de veterinários, profissionais de saúde e cientistas, dada a interface dinâmica entre pessoas, animais e ambiente. Este conceito é muito importante em zoonoses, tais como doenças associadas a carraças (DAC´s) que dependem de animais como reservatório. Os protozoários do género Babesia são agentes patogénicos transmitidos por carraças que causam a doença denominada babesiose num variado número de animais incluindo o Homem. Particularmente a B. bovis e B. bigemina são transmitidas por carraças, relacionadas com gado, Rhipicephalus (Boophilus) annulatus e R. microplus sendo estas consideradas os ectoparasitas de maior importância, com largo impacto económico na produção animal. O uso tradicional de acaricidas no controlo de carraças apresenta diversas desvantagens incluindo a seleção de carraças acaricido-resistentes e contaminação ambiental com resíduos químicos. As vacinas destacam-se como uma alternativa ao uso de acaricidas. O objetivo destas vacinas é a proteção contra DAC´s através do controlo das infestações pelos vectores e redução de transmissão de doença. As proteínas envolvidas nas interações carraça-agente patogénico podem ser bons candidatos para essas novas vacinas mas a sua identificação e validação continuam a ser obstáculos. Os objetivos do presente estudo foram, primeiro, a identificação de genes de R. annulatus diferenciadamente expressos em resposta à infeção por B. bigemina, segundo, a validação da influência destes genes no processo de infeção e finalmente a caracterização dos antigénios identificados, a fim de selecionar os melhores candidatos, para o desenvolvimento de uma potencial nova vacina. A fim de alcançar os objectivos propostos, clones de uma biblioteca de hibridização subtrativa por supressão (SSH) foram sequenciados e analisados. Os genes diferenciadamente expressos com prováveis funções relacionadas com a interface carraça- agente patogénico, foram selecionadas para validação dos resultados de SSH por real time RT-PCR. A análise funcional conduzida por RNA de interferência mostra que, nas condições do presente estudo, o silenciamento dos genes que codificam para as proteínas, sérica amilóide A e TROSPA levam á redução de níveis de infecção em R. annulatus e em R. microplus em comparação com o grupo controlo. Em R. microplus é demonstrada a influência também da calreticulina (CRT). As proteínas TROSPA e CRT foram selecionadas e obtidas usando um sistema de expressão em Escherichia coli e anticorpos poli/monoclonais foram produzidos. O reconhecimento das proteínas nativas foi confirmado por Western blotting e imunofluorescência em tecidos de carraça. O efeito dos anticorpos específicos, suplementados à refeição de sangue, foi demonstrado pela avaliação do peso final e/ou ovoposição em carraças alimentadas artificialmente. Não foi observado efeito significativo na aquisição de B. bigemina. Os resultados mostram as vantagens e desvantagens do sistema in vitro de alimentação artificial de carraças por tubos capilares na caracterização de antigénios protetores de carraça. Diferentes estudos caracterizaram a interface carraça- agente patogénico a nível molecular no entanto, o presente estudo apresenta a primeira análise funcional de genes em carraças infectadas com B. bigemina. Os resultados apresentados contribuem para um maior conhecimento do papel de genes de carraça no processo de infeção/multiplicação por Babesia sp., bem como para o desenvolvimento de novas vacinas.The “One Health” approach recognizes the need for veterinarians, human health professionals, and environmental scientists to work together given the dynamic interface among people, animals, and the environment.This approach is increasingly important for zoonotic diseases, suchas tick borne diseases (TBD ́s) which rely on animals as reservoirs. Babesiaspp. are tick-borne pathogens that cause a disease called babesiosis in a wide range of animals and also humans. Particularity, B. bovisand B. bigeminaare transmitted by cattle ticks, Rhipicephalus (Boophilus) annulatus andR. microplusbeing considered the most important cattle ectoparasites with major economic impact on cattle production. The traditional use ofchemicals to control ticks has serious drawbacks, including the selection of acaricide-resistant ticks and contamination of the environment with chemical residues. Research on alternatives to the use of acaricides is strongly represented by tick vaccines considered a more cost-effective and environmentally safe strategy. The ultimate goal of tick vaccines is to protect against TBD ́s through the control of vector infestations and reducing pathogen infection and transmission. Tick proteins involved in tick-pathogen interactions may provide good candidate protective antigens for these new vaccines but their identification andvalidation are still limiting steps. The objectives of this study were first to identify R. annulatusgenes differentially expressed in response to infection with B. bigemina, second to validate the influence of these genes in the infection in both R. annulatusand R. microplusticks and finallyto characterize identified antigens to select the best candidates for future vaccine development. In order to achieve these goals, suppression-subtractive hybridization (SSH) library clones were sequenced and analyzed. After molecular function gene ontology assignment differentially expressed genes with putative functions in tick-pathogen interactions were selected for validation of SSH results by real-time RT-PCR. Functional analysis by RNA interference showed that under the conditions of the present study,knockdown of trospaand serum amyloid A significantly reduced B. bigeminainfection levels in R. annulatusand R. micropluswhen compared to controls. In R. microplusalso calreticulinshowed infection reduction. TROSPA and CRT were selected, recombinant proteins were obtained using Escherichiacoliexpression system and poly/monoclonal antibodies were generated. Their specificity against tick recombinant proteins was confirmed by Western blottingand against native proteins in tick tissuesusing immunofluorescence. Capillary-fed ticks ingested antibodies added to the blood meal and the effect ofthese antibodies on tick weight and/or oviposition was shown. No significant effect was observed on pathogen acquisition. The results highlighted the advantages and disadvantages of in vitrotick capillary feeding for the characterization of candidate tick protective antigens. Several studies have characterized the tick-pathogen interface at the molecular level. However, to our knowledge this is the first report of functional genomics studies in ticks infected with B. bigemina. The results reported here increased our understanding of the role of tick genes in Babesiainfection/multiplication and contribute to the development of a vaccine with impact on both tick infestation and pathogen infection
