Hadsbjerg, Johanne

En vigtig proces i den virale livscyklus er evnen til effektivt at producere nye virale afkom. Virusreplikationer en kompleks proces, der involverer virale proteiner, interaktioner i det viralegenom og samspil med værtsproteiner. Identifikation af afgørende faktorer for genomreplikationen af vigtige humane og animalske patogener vil lette bestræbelserne på, at finde nye metoder til effektiv sygdomsbekæmpelse. Hovedformålet med denne afhandling er at karakterisere vigtige faktorer involveret i replikationen af klassisk svinepestvirus (CSFV). Klassisk svinepest er en særdeles smitsom virussygdom, der rammer tamsvin og vildsvin, og den har en stor samfundsøkonomisk betydning for lande, som Danmark, der har en væsentlig handel indenfor landbrugsproduktionen. CSFV har, ligesom andre RNA-virus, en høj mutationsrate, hvilket tillader virusset at tilpasse sig ændringer i selektionstryk. Derfor vil et mere indgåendekendskab til sekvensvariationen, samt mekanismerne under virus-replikationen være afgørendefor udformningen af effektive vacciner og til diagnostiske formål. Denne afhandling består af fire dele: En oversigt bestående af en generel introduktion (del 1) og en diskussion (del 4), der beskriver biologien af CSFV med fokus på den virale livscyklus samt strukturelle RNA elementer, som er vigtige for virus-replikationen. Dette giver et teoretisk grundlag og en perspektivering til arbejdet udført i løbet af denne ph.d., som er skitseret i del 2, der opsummerer ph.d.-projektets mål og resultater. Disse resultater er beskrevet til bunds i del 3 indeholdende de tre manuskripter, der indgår i afhandlingen. Manuskript 1 fokuserer på tilpasninger, der observeres i CSFV-genomet efter at mutationer er introduceret i det interne ribosom indgangssted (IRES), samt efter gentagne passager i cellekultur og ved in vivo forsøg. Tilpasninger i sekvensen ses i de kodende regioner for NS2 ogNS5B, som gendanner den kodende sekvens til den som findes i den oprindelige virusstamme. Ved podning af grise, med virus indeholdende muterede IRES-elementer, blev der ikke observeret kliniske symptomer og der blev kun påvist begrænsede mængder af viralt RNA. Imodsætning hertil forårsagede podning med vildtypevirus kliniske symptomer, som også observeres i den oprindelige virusstamme. Ved at undersøge tilpasningen af virus i hele dets genom under virus-replikationen kan det give en mere omfattende forståelse af de virusegenskaber, der kan forklares ved mere end blot at kende konsensussekvensen. I manuskript 2 undersøges faktorer afgørende for virus-replikationen ved at analysere et sekvensmotiv i den kodende region af NS5B, som har mulighed for at danne langtrækkende RNA-RNA interaktioner. Et CSFV replikon (et autonomt replikerende, men ikke-infektiøst genom) blev muteret med ikke-kodende mutationer i det ovennævnte motiv, hvilket førte til nedsat RNA-replikation sammenlignet med et vildtype-replikon. Denne effekt blev dog ikke observeret i infektiøse virus. Interessant nok opstod en ikke-kodende mutation i en bevaret del af det strukturelle CSFV-protein E1 efter passage af virus i cellekultur. Kendskab til disse sekvensvariationer og formodede langtrækkende interaktioner vil give indsigtsfuld viden i mekanismerne bag virus-translation og -replikation. I manuskript 3 blev en selektionsmarkør sat ind i et CSFV-baseret replikon, hvilket gør det velegnet til screening af antivirale lægemidler, som blokerer virus-translation eller RNAreplikation. Den kodende sekvens for neomycin phosphotransferase blev valgt som en selektionsmarkør, hvilket giver resistens over for neomycin. Neomycin-selekterbare replikoner blev designet med henblik på at gøre det nemmere at opretholde replikoner ved selektion i cellekultur og resultaterne viser, at de er fuldt funktionelle og udtrykker virusprotein. Dette kan vise sig at være nyttigt til effektivt at opretholde og udtrykke specifikke virale antigener med henblik på at producere mere effektive og sikre prototype vaccinekandidater.The ability to efficiently produce new viral progeny is an essential process in the viral life cycle.Virus replication is a complex process involving viral proteins, interactions within the viral genome and assistance from host proteins. Identification of replication determinants of important human and animal pathogens should facilitate finding new approaches for efficient disease control. The principal aim of this thesis is to characterise determinants involved in the replication of classical swine fever virus (CSFV). Classical swine fever is a highly contagious virus disease of domestic pigs and wild boar with great socio-economic importance for countries, like Denmark, that have a significant trade in agricultural production. CSFV has, like other RNA viruses, a high mutation rate allowing the virus to adapt to changes in selection pressure. Hence obtaining a more thorough knowledge of sequence variation during virus replication is crucial for the design of effective vaccines and for diagnostic purposes.This thesis is comprised of four parts: An overview consisting of a general introduction (part 1) and a discussion (part 4) which provides a review of CSFV biology with an emphasis on the viral life cycle and structural RNA elements important for virus replication. This establishes at heoretical background and provides perspectives for the work performed during this Ph.D.,which is outlined in part 2 that summarises the project aims and findings. These findings are described in-depth in part 3 comprising the three manuscripts included in the thesis. Manuscript 1 has focused on adaptations that occurred in the CSFV genome following introduction of mutations into the internal ribosome entry site (IRES) and after serial passaging in cell culture and when tested in vivo. Sequence adaptations occurred in the coding regions for NS2 and NS5B that restored the coding sequence to that of the parental field strain. When rescued viruses, containing mutant IRES elements, were introduced into pigs no induction of clinical disease could be observed and only limited levels of viral RNA were detected. In contrast, inoculation with the parental virus caused similar clinical symptoms as that observed with the parental field strain. Analysing the adaptation of the viruses throughout the entire viralgenome during virus replication allowed a more comprehensive understanding of the virusproperties beyond what can be explained by knowing just the consensus sequence. Manuscript 2 examines replication determinants by analysing a sequence motif in the codingregion of NS5B which has the possibility to form long-range RNA-RNA interactions. When synonymous mutations were introduced into this motif in a CSFV replicon (a self-replicatingbut non-infectious genome) reduced RNA replication was observed compared to a wild type replicon. However, this effect was not observed in the context of the infectious virus. Interestingly, an adaptive silent mutation in a conserved part of the structural CSFV protein E1 occurred upon virus passaging in cell culture. Knowledge of these sequence variations and putative long-range interactions will provide valuable insights into mechanisms underlying virustranslation and replication. In manuscript 3, a selection marker has been inserted into a CSFV-based replicon making it suitable for screening of antiviral drugs that block virus translation or RNA replication. The neomycin phosphotransferase coding sequence was chosen as a selection marker which confers resistance to neomycin. The neomycin-selectable replicon was demonstrated to be functional and designed with the aim of facilitating the maintenance of replicons by selection within mammalian cells. This might prove to be useful for the maintenance and expression of specific viral antigens in an efficient manner in order to produce more effective and safer prototype vaccine candidates

Online Research Database In Technology

Functional analysis of replication determinantsin classical swine fever virus

http://orbit.dtu.dk/ws/files/140644494/13_07519_34_PhD_thesis_Johanne_Hadsbjerg.pdf_2623812_1_1.pdf

Functional analysis of replication determinantsin classical swine fever virus

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Online Research Database In Technology