International Laboratory for Research on Animal Diseases

CGSpace (CGIAR)

Dr. Jon Wilkes places into a scintillation counter vials holding different populations oftrypanosome parasites that have been incubated with the anti­trypanosome drug Samorin®. Thedrug has been labelled with radioactive molecules. The scintillation counter measures theamount of radioactivity in each vial. This tells the scientist how much drug has been taken up bythe different parasite populations. Drug­resistant populations have evolved ways of reducingtheir drug uptake.RAPD fingerprinting of trypanosomesCHARACTERIZING and diagnosing trypanosome infections in animals is complicated by theexistence of many disease­causing subgenera, species and subspecies of the genusTrypanosoma, in addition to the occurrence of several apparently harmless trypanosomepopulations. Three subgenera—Nannomonas, Duttonella and Trypanozoon—cause large,widespread losses in livestock productivity throughout the tropical and subtropical regions of theworld. Members of the Nannomonas subgenus cause the greatest ruminant losses due totrypanosomiasis in sub­Saharan Africa; five genetic types of parasites have been identified withinthis subgenus. Two subspecies in the Trypanozooon subgenus—Trypanosoma bruceirhodesiense and Trypanosoma brucei gumbiense—cause life­threatening human diseases.Complicating the picture still further are mixtures of parasites of the same or different subgenera,species or subspecies infecting an animal simultaneously.What is needed by both scientists and animal disease control workers are systems for quicklyand efficiently distinguishing among the many trypanosome populations. Such systems wouldenable workers to make accurate diagnoses, to obtain sound epidemiological data and tooptimize the use of chemotherapy to prevent and treat trypanosomiasis.SEVERAL TECHNIQUES are used to distinguish the different populations of trypanosomes thatinfect people and their domestic animals. Antigen­trapping enzyme­linked immunosorbentassays (antigen­ELISAs) are a cost­effective technique for diagnosing infections in the field (seethe October 1988 issue of ILRAD Reports). Other technologies, based on the binding ofcomplementary single strands of DNA (deoxyribonucleic acid), identify trypanosomes withunparalleled sensitivity (January 1991 ILRAD Reports). The latter technologies have the furtheradvantage that DNA is more robust and stable than the proteins and antibodies used in themonoclonal antibody­based antigen­ELISAs. For the most part, however, the DNA­basedtechnologies have been restricted to laboratory work because they require use of radioactivechemicals.The standard polymerase chain reaction techniqueThe polymerase chain reaction technique is used to amplify specific regions of an organism'sDNA to levels where the DNA fragment can be identified. The technique generally requires apair of short pieces of single­stranded DNA composed of 20 nucleotide bases, calledoligonucleotides, which are specifically synthesized for the reaction. Each paid of oligo­nucleotides is specific for the section of the genomic DNA of the organism being analysed.These oligonucleotides under particular conditions will bind to their complementarysequences in the genomic DNA and act as 'primers' that initiate copying of a specific regionof the DNA of the organisms under study.Two primers are used—one for each strand of the DNA double helix. The DNA strands of thedouble helix are copied, or synthesized, in opposite directions. Only a short region of thegenome is amplified. Each round of amplification effectively doubles the copy number of theDNA region being amplified. After only 30 rounds of amplification, the copy number of thespecific sequence increases over one million­fold. This amount of DNA is easily seen afterstaining with a DNA­binding reagent when the reaction products are separated byelectrophoresis in a gel.Several recent developments are now making these technologies attractive for field as well aslaboratory use. These include an increasingly widespread use of the polymerase chain reaction(PCR) technique, the advent of new systems for detecting parasite DNA that require noradioactive labelling and are more sensitive and reliable than those used in the past, andincreasing cost­effectiveness of the technologies. The DNA based technologies are thus likely inthe future both to improve diagnosis of infections and to advance epidemiological studies.The PCR technique is used to amplify a specific region of an organism's DNA to levels wherethe DNA fragment can be identified (see the box on this page and the October 1991 ILRADReports). Although powerful, PCR requires that a pair of short pieces of single­stranded DNA besynthesized specifically for each DNA sequence to be detected by subsequent amplification inthe reaction. Moreover, to generate these primers, known as oligonucleotides, DNA of therelevant genes must first be sequenced. In addition, use of the PCR with a pair of primers for aspecific DNA sequence does not produce different reaction fragments—seen in a gel as DNAbands of different sizes—and thus cannot distinguish isolates of the same species oftrypanosome.SCIENTISTS have now developed more refined systems for identifying organisms on the basisof stretches of their DNA. The breakthrough was made by two American groups that firstidentified closely related organisms using genetic 'fingerprints' produced by amplifying DNA ofthe organisms with arbitrary primers. This technique, soon dubbed 'RAPD' for 'random amplifiedpolymorphic DNA' (the method is also, less euphoniously, known as AP, for 'arbitrary primer'­PCR), uses single primers of arbitrary sequence of only 10 nucleotides in length rather than thelonger (20­nucleotide) pairs of primers for specific sequences used in the standard PCR method.Because of their shorter sequences, the arbitrary primers used in the RAPD technique will bindto many stretches of DNA in an organism's genome—that is, to the many sites that have acomplementary, or nearly complementary, sequence of nucleotide bases.As organisms evolve, fragments of their DNA may be deleted or inserted or changed throughgenetic mutation. The arbitrary primers point up such differences among closely relatedpopulations by generating different­sized PCR products, which appear as different­sized bandson a gel, or by generating products with DNA from one population (bands) but no products withDNA from another population (no bands). The differences are easily demonstrated by runningthe DNA amplified from different organisms alongside each other in gels (see the figure on thispage). The degree to which two organisms are related is indicated by the degree to which thefingerprint or pattern of bands produced in a RAPD reaction are similar.The RAPD technique thus overcomes some limitations of the standard PCR reaction: it enablesscientists to generate a fingerprint of the genome of an organism that can be used to identify theorganism rapidly, even when only a few of the organisms are present in samples being analysed.The main advantages of the RAPD method are that a single short primer is sufficient todifferentiate many different organisms and that to produce the primer the experimenter needs noprior information about DNA sequences in the organism of interest. The technique can generatefingerprints of different populations of the same species, which can then be used to distinguishthe populations from each other. Due to the complexity of trypanosomiases, this advantage isparticularly important in detailed studies of trypanosome infections in the field. For example,individual parasite populations that are particularly virulent could be followed and their influenceon the epidemiology of the disease in the field monitored.SCIENTISTS at ILRAD have used the RAPD technique to determine differences among andwithin species of trypanosomes. The fingerprints produced from DNA of members of threetrypanosome subgenera —Nannomonas, Trypanozoon, and Duttonella—have been examinedafter using different arbitrary 10­mer oligonucleotides to amplify DNA from these organisms. Ofthe primers tested, one designated ILO 525, with a nucleotide base sequence of 5'CGGACGTCGC 3', distinguished the three subgenera from each other and also producedidentifiable fingerprints for the different parasite populations within each of the subgenera.The different fingerprint patterns, or polymorphisms, generated using this primer allowedscientists easily to differentiate five previously identified subtypes of the Nannomonas group:Trypanosoma simiae and the Kilifi­, Tsavo­, savannah­ and West African forest/riverine­types ofTrypanosoma congolense. Although T. simiae is morphologically indistinguishable from othermembers of the Nannomonas subgenus, most of which are pathogenic in cattle, T. simiae is theonly one of the subgroup to be particularly pathogenic in pigs.The different DNA products of four Nannomonas isolates—Trypanosoma congolense Kilifi (lane2), forest/riverine (West African), (lane 3) and savannah (lane 4), and Trypanosoma simiae (lane5)—generated using the RAPD method, separated by electrophoresis in a gel and stained with adye that binds to the DNA and allows it to be visualized with ultraviolet light.RAPD fingerprints of T. simiae populations differed markedly from the fingerprints of the othermembers of the Nannomonas group. For all the T. congolense parasites analysed,oligonucleotide ILO 525 generated fingerprints that not only unequivocally identified the speciesbut also revealed polymorphisms among the different isolates of the same subspecies.Disadvantage of RAPDsA disadvantage of using the RAPD technique to identify trypanosomes is that theparasites must be purified from host nucleate cells: any contamination by host DNAwill alter the fingerprint patterns.This separation is achieved by passing host blood samples over DEAE­cellulosecolumns. To be effective, this technique requires relatively that the host have highdegrees of parasitaemia to provide sufficient numbers of parasites.Modifications of this technique or new procedures for isolating trypanosomes need tobe developed before the RAPD technique can reach its full potential in diagnosis andepidemiological studies of trypanosomiasis.THE FINGERPRINTS produced using primer ILO 525 divided members of the Trypanozoonsubgenus into three major groups: (1) Trypanosoma brucei brucei and T. b. rhodesiense, (2) T.evansi and (3) T. b. gambiense.Group one comprised T. b. brucei populations from East and West Africa, which do not infecthumans, and T. b. rhodesiense, which is found in several areas in Africa and does infect people.Although the fingerprints did not distinguish T. b. brucei from T. b. rhodesiense, the profiles ingroup one were sufficiently different to identify different isolates. The inability of the RAPDmethod to differentiate T. b. brucei and T. b. rhodesiense lends support to results of DNAhybridization and isoenzyme comparisons that suggest that these two subspecies arecomponents of a single species group and that T. b. brucei can potentially infect people.Group two comprised all isolates of T. evansi, which are morphologically similar to the othermembers of the Trypanozoon subgenus but are transmitted globally in tropical and subtropicalregions not by tsetse but by other biting flies. Their distinction from other Trypanozoon isolateswas indicated by the absence of one DNA band in the fingerprint and the presence of a larger,less intense band. Analysis of the sequences of the two DNA bands showed them to differ fromeach other. To date, the RAPD technique has not revealed qualitative differences among the T.evansi isolates. More oligonucleotides need to be tested to identify arbitrary primers that willreveal differences in the fingerprints of these T. evansi isolates.Group three comprised T. b. gambiense isolates from West Africa. This organism causes humansleeping sickness. The RAPD technique, again carried out with ILO 525, generated two sorts ofDNA fingerprints for the T. b. gambiense isolates tested. Both sorts of fingerprints lacked the twobands that distinguish the other two Trypanozoon groups. This division of T. b. gambiense intotwo types agrees with earlier subdivisions of isolates of this organism that were made on thebasis of different variant surface glycoprotein genes possessed by the two types.Application of the RAPD technique using T. vivax isolates of the Duttonella subgenus from SouthAmerica and Africa has confirmed results of previous analyses and facilitated differentiation ofisolates that in the past could be accomplished only by employing a combination of severalrelatively tedious techniques. Primer ILO 525 was again found to be the most useful indistinguishing these parasites. The RAPD method not only placed all non­Kenyan T. vivax intoone group containing widely distributed isolates from Africa and South America, but alsogenerated isolate­specific patterns that may, in the future, enable scientists to identify regions ofthe genome encoding genes responsible for the expression of different traits, such as resistanceto drugs and an ability to infect rodents, to induce haemorrhagic disease and to be transmitted bytsetse.The similarities observed between the West African and South American (Colombian) T. vivaxpopulations supports the generally held hypothesis that the South American parasites arederived from tsetse­transmitted West African trypanosomes. The number of South Americanparasites sampled so far, however, is insufficient to determine the degree of heterogeneityamong the South American isolates and whether this parasite was imported from Africa on oneor on several occasions.IN SUMMARY, use of the single oligonucleotide primer ILO 525 at ILRAD in the RAPDtechnique—rather than pairs of primers needed to identify each different parasite population inthe standard PCR technique—has enabled scientists to differentiate the different subgenera,species and individual isolates of trypanosomes from Africa and South America. This advantagegreatly simplifies and extends the possibilities in studies of the epidemiology of trypanosomiasis.In the future, scientists may use this technique to identify genes expressing traits of importance.Like other PCR based methods, the RAPD method uses very small quantities of DNA (billionthsof a gram) and therefore can be used to identify infecting organisms even when samples containas few as a hundred parasites.ILRAD Reports is published quarterly by the International Laboratory for Research on AnimalDiseases (ILRAD) in Nairobi,. Kenya. The newsletter is written, designed and electronicallylaid out to camera­ready stage in­house using a personal computer and laser printer. Thenewsletter is printed in Nairobi by Majestic Printing Works. It has a circulation of 3 500English and 500 French readers and is available free upon request. Material in the Reportsmay be reproduced without prior permission but we ask that credit be given and that twocopies of the reprint be sent to ILRAD's Science Writer, Susan MacMillan: telephone + 254(2) 632­311 telefax + 254 (2) 631­499 telex 22040 ILRAD. electronic mail: (BT Tymnet)CG1017ILRAD was founded in 1973 to conduct research into better ways of controlling livestockdiseases. The current primary goal of the Laboratory is to develop safe, effective andeconomical methods to control two parasitic diseases that severely constrain animalproduction in Africa:trypanosomiasis, transmitted to animals by the bite of a tsetse fly, andEast Coast fever, a virulent form of theileriosis, transmitted to cattle by ticks. Aninternational staff of about 50 scientists conducts basic research much of it aimed at thedevelopment of vaccines in the fields of biochemistry, cell biology, electron microscopy,epidemiology, genetics, immunology, molecular biology, pathology, parasitology and thesocio economics of animal disease controlILRAD is one of 18 international agricultural research centres sponsored by the ConsultativeGroup on International Agricultural Research (CGIAR). The secretariat of the CGIAR islocated in the World Bank headquarters in Washington D.C. The CGIAR is an informalumbrella organization of 40 national governments, international organizations and privatefoundations that together provide about US$300 million annually to the 18 centres forresearch., training and advisory services. The CGIAR aims to help farmers in developingcountries increase their production of staple food crops livestock fish and trees in ways thatimprove the nutrition and well­being of low­income peoples and the management of naturalresources.

RAPD fingerprinting of trypanosomes

https://cgspace.cgiar.org/bitstream/10568/16310/1/rapd_fingerprinting.pdf

RAPD fingerprinting of trypanosomes

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

CGSpace (CGIAR)