International Laboratory for Research on Animal Diseases

CGSpace (CGIAR)

COS cells were transfected with the gene library and probed with anti bodies specific fora schizont antigen. Using an enzyme­based­detection system, scientists identified theCOS cells containing the relevant plasmids. The recombinant plasmids were recoveredfrom the COS cell and the gene encoding the schizont antigen was isolated This gene willnow be used to characterize the antigen. The scientists particularly want to know if theantigen is recognized by CTLs as well as antibodies from immune cattle (see below).Identification of antigens recognized by CTLsAs mentioned earlier, CTLs are believed to be important in protecting cattle against EastCoast fever. A major objective of ILRAD's theileriosis research is to identify the parasiteantigens recognized by CTLs obtained from cattle that are immune to East Coast fever;such antigens will form the basis of an effective vaccine against the disease.One way to determine if a particular parasite antigen is recognized by CTLs is to transfectthe gene encoding the antigen into a cell line expressing the appropriate bovine MHCclass I molecule, such as the mouse fibroblasts transfected with bovine MHC class Imolecules, as described above. These cells can then be used as target cells in acytotoxicity assay to determine whether the gene encodes an antigen recognized byCTLs from an immune animal. In this way, it may be possible to identify from an array ofcandidate antigens those that could induce a protective CTL response. These antigenswould form the basis of an effective vaccine against East Coast fever.This article is based on reports of ILRAD studies of gene transfection written by Noel Murphy(trypanosomes) and Philip Toye (mammalian cells). Other ILRAD scientists involved in themammalian cell transfection studies were Niall MacHugh, Ivan Morrison (now at the ComptonLaboratory, UK), Jan Naessens and Alan Teale. Collaborators in this work include Piet Borst,of the Netherlands Cancer Institute (Amsterdam), and Hans Clevers and colleagues at theUniversity Hospital, Utrecht, the Netherlands. The following article (page 5) is based on areport by former staff member Vinand Nantulya.CORRECTIONThe wording of a paragraph (page 2, last paragraph) in the recently published ILRAD 1991Highlights is misleading. The paragraph should read as follows:During the year, ILRAD scientists also identified a 24­kDa molecule present in infected bovinelymphocytes. The purified molecule was recognized in vitro by clones of helper T cells derivedfrom immune cattle. The role of the 24­kDa antigen in inducing protective responses to T.parva is being investigatedNew tools for better diagnosis of AfricantrypanosomiasisDIAGNOSIS is a critical element in the management of disease, both at the level of theindividual animal when the decision to treat or not to treat has to be taken and forevaluating the success of disease control programs. The diagnostic tests used should besimple, rapid, specific and highly sensitive. They should also be able to differentiatebetween closely related parasite species if the disease syndromes they cause requiredifferent management approaches. Ideal tests should be suitable for field application andthe cost should be within the means of the communities affected by the disease. ILRADhas developed simple tests for diagnosis of African trypanosomiasis that promise to fulfilmany of these requirements.Trypanosomiasis is characterized by severe anaemia, weight loss, reduced productivity,infertility and abortion, with death occurring in some animals during the acute phase ofthe disease. Animals that survive often remain infected with trypanosomes for severalmonths or years and exhibit a low level of fluctuating parasitaemia. During this phase, theanimals may manifest no overt clinical signs.The standard laboratory method for confirmation of the diagnosis of Africantrypanosomiasis is to identify trypanosomes in tissues of the infected host, usually inperipheral blood. This method, however, is unsatisfactory, because a high proportion ofinfections are not detected. Alternative methods of diagnosis have therefore beendeveloped, most of which are for the detection of antibody responses to the antigens ofthe infecting trypanosomes. Antibody detection tests, however, have severalshortcomings: the antigens used are ill­defined, thus making standardization of the testsdifficult with regard to sensitivity and specificity. Moreover, detection of antibody in serumdoes not necessarily reflect an existing infection, because antibodies may persist forseveral months following recovery.Although undetectable in peripheral blood, trypanosomes can still be found sequesteredin several other tissues of the infected host, such as the spleen, lymph­nodes, bonemarrow and liver. Successive trypanosome variable antigen types in these populationsare destroyed by the immune responses of the infected host as it attempts to eliminatethe parasites. Several soluble antigens are thus released in the tissue fluids, includingsome that are trypanosome species­specific. Detection of these antigens thus providesdirect evidence that an animal has a current infection. This is the rationale of the antigen­detection enzyme immunosorbent assays (antigen ELISAs) that have been developed fordiagnosing African trypanosomiasis.ILRAD scientists have developed three tests: one is specific for the parasite speciesTrypanosoma vivax, one for T. congolense and one for the brucei group oftrypanosomes, which includes animal­infective T. brucei and T. evansi and human­infective T. rhodesiense and T. gambiense.INITIAL EVALUATION of the tests for animal trypanosomiasis was conducted with stafffrom the Kenya Trypanosomiasis Research Institute (Muguga). Field sera were obtainedfrom cattle in a trypanosomiasis­endemic area at Nguruman, Kenya. The three testswere able to detect trypanosome antigens in the sera of 121 (96.0%0) of 126 animalswith parasitologically confirmed diagnosis. More importantly, the tests also detectedantigens in 52.6% of animals in the same herd that had not been diagnosed as infectedby parasite detection techniques, thus demonstrating the superior sensitivity of theantigen­ELISAs. Use of the latter tests enabled scientists also to detect mixed infectionsinvolving two or three trypanosome species. Furthermore, these assays proved highlyspecific: control sera obtained from cattle in a trypanosomiasis­free area of Kenya (atKapiti) all tested negative using the three assays.Applied to the diagnosis of T. evansi infections in camels and pigs, the test forTrypanozoon­specific antigens was positive in 92% of the animals with detectableparasitaemia. Once again, infections in a high proportion of animals undetected byparasitological techniques (55%) were detected using the antigen­ELISA. Controlanimals from a T. evansi­free area all tested negative with the latter.FOLLOWING the initial successful field testing in Kenya, the tests were introduced forfurther evaluation in Ghana, Mali, Senegal, The Gambia, Tanzania, Zambia, Zimbabweand Uganda. These field evaluation activities have been supported by the Government ofthe Netherlands in a collaborative project involving the Food and Agriculture Organizationof the United Nations (FAO, Rome) and the International Atomic Energy Agency (IAEA,Vienna). The test specific for the T. brucei group has also been evaluated for its utility indiagnosing T. evansi infections in camels in Mali and Kenya and in diagnosing humantrypanosomiasis in Côte d'Ivoire, Tanzania, Uganda, Zambia and Zaire. This evaluationwas conducted under the auspices of the United Nations DevelopmentProgramme/World Health Organization/World Bank Special Programme for Researchand Training in Tropical Diseases (Geneva).Results of these validation exercises were presented at an FAO/IAEA ResearchCoordination Meeting held in Côte d'Ivoire in May 1991. Participants of this meetingconcluded that the two antigen­ELISAs that detect species­specific invariant trypanosomeantigens have been successfully introduced and established at 10 of the 11 institutesinvolved in the validation exercise. The participants reported that in detecting activetrypanosome infections, the antigen­ELISAs demonstrated a sensitivity 4–5 times greaterthan that of the more commonly used buffy coat technique. It was concluded that theantigen­ELISAs clearly have potential use in the development of strategies for monitoringand controlling animal trypanosomiasis.Clearance of antibody–VSG complexes bytrypanosomes (Ph.D.Thesis)CATTLE INFECTED with trypanosome parasites are known to produce antibodiesagainst molecules known as VSGs that are located on the surface of trypanosomes. Hostanti­bodies bound to parasite VSG mediate the killing of the parasites by other elementsof the bovine immune system, such as macrophages and neutrophils. This is the mainmethod by which the immune system clears trypanosomes from the body. It is alsoknown, however, that trypanosomes can remove antibody bound to their VSG. Becausethis antibody removal has important implications for the control of the parasites, studieswere undertaken to determine the trypanosome mechanisms responsible for cleavingVSG­antibody complexes.The binding of antibodies that specifically recognize VSG molecules exposed on thesurface of clones of Trypanosoma brucei, Trypanosoma congolense and Trypanosomavivax was investigated using both immunofluorescence (light microscopy and afluorescence­activated cell sorter) and electron microscopy. In addition, parasites of theT. brucei S427 clone 22, which were adapted to cultures containing no feeder cells, wereincubated with specific F(ab)2 and Fab antibody fragments or with biotin.After incubation at 0°C, antibodies, antibody fragments and biotin molecules wereobserved over the whole parasite surface; fluorescence appeared strongest at theparasite's flagellum. Upon warming to 37°C, surface­bound antibody and antibodyfragments were cleared from the parasite surface. Even in the absence of antibody­mediated crosslinking of VSG (i.e., Fab), clearance occurred through the movement ofsurface­bound Fab­VSG complexes toward the flagellar pocket. Studies of permeabilizedtrypanosomes using electron microscopy and immunofluorescence showed that afterbeing cleared from the cell surface, small amounts of antibody were located intracellularlybetween the nucleus and the flagellar pocket. However, when a cocktail of proteaseinhibitors was added to the culture medium, large amounts of antibody or antibodyfragments could be detected within vacuoles situated between the nucleus and theflagellar pocket, suggesting that proteases are required to break down antibody–VSGcomplexes. Different antibodies were cleared at different rates. Antibodies with both ahigher molecular mass and more than one antigen­binding site were generally clearedmost rapidly.Movement of antibody­VSG complexes was inhibited at temperatures below 4°C and byadding 2­deoxy­Dglucose in lieu of D­glucose to the culture medium. Movement wasimmediately and reversibly inhibited by increasing the NaCl concentration in the mediumto 200 mM. Antibody clearance was also inhibited by protein synthesis inhibitors andprotease inhibitors. The process was not inhibited by microfilament (cytochalasin B andD) or microtubule (nocodazole) disrupters, nor was it altered by an increase in mediumviscosity.IN SUMMARY, the results of these studies showed that antibody clearance intrypanosomes is a directional, energy­dependent process. It is not dependent oncrosslinking of VSG and it is selective: only VSG bound to antibody is cleared.Antibody clearance may have an important role to play in the process of antigenicswitching in trypanosomes in which the parasites periodically remove one coat of VSGand replace it with another of a different antigenic type. An antibody response to a

New tools for better diagnosis of African trypanosomiasis

https://cgspace.cgiar.org/bitstream/10568/16303/1/new_tools.pdf

New tools for better diagnosis of African trypanosomiasis

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

CGSpace (CGIAR)