O início do século 21 tem sido marcado pelo aumento das doenças crónicas. Este desenvolvimento resultou num crescimento do interesse na criação de novas terapias, com foco na recuperação de tecidos através da transplantação do tecido danificado por matrizes “inteligentes” desenvolvidas recorrendo ao uso da Engenharia Biomédica. A descelularização, um processo que visa a remoção de material celular imunogénico de um tecido ou órgão, tem-se tornado num meio atraente para o desenvolvimento de novas matrizes funcionais e bioativas. A presente tese teve como objetivo explorar novas metodologias para a descelularização de tecidos biológicos. Para este propósito, é apresentada uma revisão da literatura relevante e um estudo que investiga o potencial de três diferentes protocolos para a descelularização de osso trabecular porcino usando o fosfato de tri-n-butilo (TnBP), dióxido de carbono supercrítico (scCO2), e uma combinação de ambos. O uso do TnBP como um agente de descelularização, ao invés do uso de produtos químicos mais prejudiciais como os detergentes, pode levar a uma maior preservação da matriz extracelular (ECM), tal como a propriedades bioquímicas e mecânicas mais desejáveis para a matriz resultante. O uso do scCO2 pode, também, resultar num processo de descelularização mais rápido, levando não só a uma redução do tempo de exposição dos tecidos a produtos químicos potencialmente prejudiciais, mas também a uma redução do preço financeiro deste processo. No total foram implementados e examinados cinco protocolos diferentes: 1% (v/v) TnBP durante 48 horas, scCO2 durante 1 hora e 3 horas, e scCO2 com 0.1% (p/v) TnBP com durante 1 hora e 3 horas. Devido à natureza inovadora deste projeto, usaram-se variáveis temporais para estudar qualquer efeito prejudicial devido ao efeito da exposição prolongada ao scCO2. Os resultados obtidos revelaram que tanto o TnBP como o scCO2 conseguiram diminuir a quantidade de DNA presente nas amostras, mas esta diminuição foi maior nos protocolos que onde o TnBP foi usado. A análise às propriedades mecânicas dos tecidos sujeitos a TnBP revelaram um aumento da força máxima e da tensão de limite elástico, o que poderá significar que ocorreu crosslinking das fibras de colagénio. Já o uso do scCO2 resultou na desidratação das amostras, aumentado os valores para o módulo de Young e força máxima. O protocolo de combinação scCO2-TnBP causou uma diminuição para metade da quantidade de DNA presente nas amostras tratadas em comparação a não-tratadas, demonstrado o potencial desta metodologia inovadora e abrindo novas possibilidade para otimizações futuras.The beginning of the 21st century has been marked by the rise of chronic diseases. This development has led to increased interest in the development of new therapies that focus on restoring normal tissue function through transplantation of injured tissue with biomedically engineered smart matrices. Decellularization, a process that focuses on the removal of immunogenic cellular material from a tissue or organ, has become an appealing methodology for the creation of functional and bioactive scaffolds. The present thesis focused on the creation of new methodologies for the decellularization of biological tissues. For this purpose, the author reviewed current decellularization literature and put forward a study that investigated the potential of three different decellularization protocols for porcine trabecular bone tissue using Tri(n-butyl) phosphate (TnBP), supercritical carbon dioxide (scCO2), and a combination of both. The use of TnBP as a decellularization agent, instead of harsh chemicals such as detergents, could lead to better preservation of the extracellular matrix (ECM), and better biochemical and mechanical properties to the resulting scaffold. As well, the use of supercritical fluids could lead to faster decellularization times, not only reducing the time tissues are exposed to potentially harmful agents, but also reducing the financial cost of the process. In total, five different protocols were implemented and examined: 1% (v/v) TnBP treatment for 48 hours, scCO2 treatment for 1 hour and 3 hours, and scCO2 treatment with 0.1% (w/v) TnBP for 1 hour and 3 hours. Due to the innovative nature of this work, time variants to protocols were implemented to investigate any possible harmful effects caused by prolonged exposure to scCO2 treatment. Results revealed that both TnBP and scCO2 led to the removal of DNA content, but this effect was more pronounced in treatments that used TnBP. Mechanical analysis of TnBP-treated samples revealed a higher ultimate strength and yield strain, suggesting some degree of crosslinking of collagen fibers occurred. Meanwhile, the use of scCO2 led to dehydration of samples, increasing values for Young’s Modulus and ultimate strength. The combined protocol of scCO2-TnBP led to a decrease in DNA content to about half of that measured for untreated samples, demonstrating the potential of this methodology and opening new possibilities for future optimizations that could achieve required decellularization levels
