Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentació

Avilés, C.

Azor Ortiz, Pedro Javier

Dorado, Gabriel

Fernández, I.

Membrillo Del Pozo, Alberto

Molina, A.

Álvarez, F.

idUS. Depósito de Investigación Universidad de Sevilla

DETECCIÓN DE SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMSEN GENES RELACIONADOS CON LA TERNEZA DE LACARNE (CAPN1 Y CAST) EN LAS RAZAS BOVINASAUTÓCTONAS ESPAÑOLASAvilés C.1, Azor P.J.1, Membrillo A.1, Dorado G.2, Álvarez F.3,Fernández I.3, Pérez J.A.3, Molina A.11 Grupo MERAGEM. Departmento de Genética. Facultad de Veterinaria. Universidadde Córdoba. España. E-mail: agr158bovinos@gmail.com2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Córdoba.España.3 Asociación Nacional de Criadores de Ganado Vacuno Selecto de Raza Retinta.España.INTRODUCCIÓNLos avances en genética molecular en las últimas décadas han permitidola identificación de gran cantidad de marcadores genéticos asociados congenes que afectan a caracteres de interés en producción ganadera, inclu-yendo genes simples con efectos importantes en el fenotipo o QTL (regio-nes genómicas que afectan a caracteres cuantitativos) (Dekkers, 2004).Estas nuevas tecnologías han proporcionado herramientas con un granpotencial para mejorar la respuesta a la selección, especialmente cuando setrata de caracteres que son difíciles de mejorar a partir de prácticas con-vencionales por su baja heredabilidad o porque los métodos para cuantificarsu expresión son caros, destructivos, poco precoces en la vida del animal odifíciles de llevar a cabo.El objetivo de este trabajo ha sido caracterizar a las razas bovinas autóc-tonas mejoradas para los genes que codifican al enzima µ-calpaína y a su inhi-bidor (calpastatina), genes éstos vinculados al carácter terneza de la carneque es el principal atributo de la calidad de la carne para el consumidor.151MATERIAL Y MÉTODOSPara la obtención de ADN genómico se tomaron muestras de materialbiológico (pelo, sangre o músculo) de individuos de las razas Retinta (90),Avileña Negra Ibérica (25) y Morucha (25). Además para hacer el análisis decomparación con otras razas bovinas se tomó material genético de otrasrazas autóctonas menos seleccionadas como las razas Cárdena Andaluza(5), Berrenda (5), Pajuna (5), y Toro de Lidia (5), y de razas especializadasde crecimiento elevado como es el caso de las razas Limousin (25) oChianina (5). Finalmente se incluyeron animales de razas de aptitud lecheraFrisona (5) o Normanda (5).La extracción del ADN genómico se llevó a cabo por las técnicas de sal-ting out (Miller et al., 1998), purificación con fenol-cloroformo o a partir deun kit comercial de extracción de Qiagen® en función del tipo de muestra.Amplificación y secuenciación de los genes CAPN1 y CAST bovi-nos. Una vez obtenido el ADN se amplificaron 2 fragmentos de ADN (subu-nidades s1 y s2) pertenecientes al gen CAPN1 (GenBank AccessionsAF252504 y AF248054) y un fragmento de ADN perteneciente al gen CAST(GenBank Accession AY008267). La primera región secuenciada del genCAPN1 presenta una longitud de 669 pb, conteniendo el exón 8, exón 9 yparte del exón 10 del gen con sus correspondientes intrones intermedios. Lasegunda secuencia, que cuenta con 765 pb, contiene parte del exón 13, elintrón 13 y el exón 14 del mismo gen. La secuencia amplificada del genCAST (BTA7) posee 270 pb y contiene los exones 5 y 6 y el intrón 5 de dichogen. Las amplificaciones se llevaron a cabo mediante reacción en cadena dela polimerasa (PCR) en un termociclador Eppendorf (Eppendorf® AG,Hamburg, Germany). Los cebadores empleados en la PCR se diseñaron conla aplicación informática Primer3®. Los amplicones se purificaron y compro-baron en un gel de agarosa al 2 % con bromuro de etidio. La reacción desecuenciación se realizó en un secuenciador automático ABI 3130 (AppliedBiosystems®).Búsqueda de polimorfismos y tratamiento estadístico. Las tressecuencias fueron examinadas y alineadas con el programa Sequencherv.4.6. (Gene Codes Corporation®, 1991-2006). Una vez alineadas y compa-radas con las secuencias publicadas en diversos artículos y en el GenBankse detectaron los sitios polimórficos y se determinaron los correspondientesgenotipos. La estimación de las frecuencias fue realizada por simple conteodado el carácter codominante de los marcadores SNPs.El estudio de asociación entre los diferentes SNPs y las razas se basó enun test de máxima verosimilitud utilizando las frecuencias de cada raza paralos diferentes genotipos de cada sitio. Se realizaron diferentes análisis agru-Consejería de Agricultura y Pesca152Innovación tecnológica en el ámbito de la producción animalpando estas razas por su aptitud: razas maternales mejoradas (razasde la dehesa), razas maternales no mejoradas, razas paternalesespecializadas y razas especializadas lecheras. También se analizarondos grupos de razas de las que existían datos en la bibliografía (Page et al.,2004; Schenkel et al., 2006) para determinados sitios polimórficos (razasinglesas, y razas europeas de doble aptitud).RESULTADOS Y DISCUSIÓNPolimorfismos detectadosSe han detectado mutaciones (SNP) en 6 sitios del primer fragmento delgen CAPN1 (tabla 1). De estas sólo la situada en la posición 5709 ha sidodescrita en otras razas.Tabla 1. Descripción de los SNPs encontrados en el gen CAPN1 subunidad1(s1) en las razas analizadas.153Locus CAPN1A CAPN1B CAPN1D CAPN1C CAPN1E CAPN1FPosición intrón 8 intrón 8 5709/exón 9 intrón 8 intrón 9 exón 10cambio nucleotídico C/T C/G C/G A/G C/T A/CEn el segundo fragmento se han detectado 3 sitios polimórficos, 2 de loscuales no han sido descritos anteriormente (tabla 2).Tabla 2. Descripción de los SNPs encontrados en el gen CAPN1 subunidad2(s2) en las razas analizadasLocus CAPN1G CAPN1H CAPN1IPosición intrón 13 4558/exón14 intrón 14cambio nucleotídico C/G G/A C/TFinalmente en el gen CAST sólo se ha detectado un polimorfismo en laposición 282 en el intrón 5 (transversión C –> G), ya descrita anteriormen-te en otras razas.En la tabla 3 se muestran las frecuencias alélicas de aparición para losprincipales sitios del gen CAPN1 y CAST en las razas estudiadas. En princi-pio no presentan grandes diferencias de distribución entre razas exceptuan-do el SNP situado en la posición 4558 de la subunidad s2 en cuyos porcen-tajes de aparición existe una mayor variabilidad en función de la raza.En el caso de los distintos alelos detectados en el gen CAST, observamosque las frecuencias de presentación oscilan entre el 90 y el 50 % con unamedia del 83% para el alelo C y entre el 10 y el 50% con una media del17% para el alelo G.Tabla 3. Relación de las frecuencias alélicas para los sitios previamentedescritos en los genes CAPN1(fragmento 1 y 2) y CAST en las distintas razasanalizadas.Consejería de Agricultura y Pesca154Gen Posición Alelos RET MOR AVI PAJ TLI BR CAR LIM CHI FRI NOR TotalesCAPN1D 5709 G 0,72 0,83 0,90 0,88 0,80 1,00 1,00 0,81 1,00 1,00 1,00 0,80C 0,28 0,18 0,10 0,13 0,20 0,00 0,00 0,19 0,00 0,00 0,00 0,20CAPN1H 4558 G 0,72 0,46 0,72 0,30 1,00 0,80 0,38 0,67 0,40 -- -- 0,66A 0,28 0,54 0,28 0,70 0,00 0,20 0,63 0,33 0,60 -- -- 0,34CAST 282 C 0,89 0,69 0,75 0,88 0,50 0,70 0,83 0,83 0,90 -- -- 0,83G 0,11 0,31 0,25 0,13 0,50 0,30 0,17 0,17 0,10 -- -- 0,17(RET: Retinta, MOR: Morucha, AVI: Avileña, PAJ: Pajuna, TLI: Toro de lidia, BR: Berrenda, CAR: Cádena andalu-za, LIM: Limousin, CHI: Chianina, FRI: Frisona y NOR: Normanda)Comparación de las diferentes razas y tipos productivosFinalmente se ha realizado una comparación de las diferentes razas ana-lizadas a partir de las frecuencias alélicas obtenidas en cada uno de los 3sitios analizados.La comparación entre las 3 razas maternales de fomento ligadas a ladehesa española de las frecuencias alélicas muestra un mayor porcentaje deanimales con alelos favorables (alelo C) en el caso de la raza Retinta y menoren la Avileña y la Morucha para el sitio CAPN1D siendo éstas estadísticamen-te significativas con un nivel de confianza del 95%. En el sitio 2 de este gen,también existen diferencias estadísticamente significativas, destacando espe-cialmente la raza Morucha que presenta un menor porcentaje de alelos favo-rables (G en este caso), frente a Avileña y Retinta (46 %la primera y 72 %las dos últimas). El análisis de las frecuencias de los alelos presentes en el genCAST para estas razas ha determinado un mayor porcentaje de alelos favo-rables en el caso de la raza Retinta del 89%, Morucha 75% y Avileña 68,7 %sin apreciarse diferencias estadísticamente significativas. Estas frecuenciasdeterminan de forma global para las 3 razas unas frecuencias alélicas de0,228 y 0,772 para el alelo C y G respectivamente en el sitio CAPN1D, 0,688y 0,322 para los alelos G y A del sitio CAPN1H y 0,830 y 0,170 respectiva-mente para los alelos C y G del gen CAST. A la vista de estas frecuencias géni-cas, es evidente que el polimorfismo CAPN1D es el principal objetivo de selec-Innovación tecnológica en el ámbito de la producción animalción, seguido del CAPN1H. En cambio la situación de estas poblaciones parael gen que codifica a la calpastatina es muy favorable (una frecuencia signifi-cativamente superior del alelo vinculado a una carne más tierna).En lo cuanto a la comparación de las razas autóctonas de fomento conlas autóctonas no seleccionadas se puede afirmar que genéticamente existeuna mejor predisposición para la terneza en el caso de las razas Avileña,Morucha y Retinta que en el resto de razas maternales analizadas aunqueprácticamente no se han encontrado diferencias estadísticamente significa-tivas (probablemente por el pequeño tamaño muestral usado en el caso delas razas maternales en peligro).La comparación con algunas de las razas continentales europeas espe-cializadas en crecimiento (generalmente en crecimiento magro) tambiéndetermina una situación más favorable para las razas maternales, aunque eneste caso las diferencias no son tan acusadas. Esto podría explicar en parte,la mayor dureza atribuida a las razas continentales cuando se explotan enpureza (también la ventaja del cruzamiento industrial con las razas mater-nales españolas).A pesar de contar con muy pocos datos se planteó la comparación denuestras 3 razas principales con razas de doble propósito europeas(Simmental y Gelbvieh). En el caso del gen CAPN1 se ha observado quenuestras razas tienen una presentación del alelo más deseable (C del sitioCAPN1D y G del CAPN1H) superior a las razas de doble propósito. En el casodel gen CAST la situación es aún mucho más favorable para nuestras razassiendo las diferencias además altamente significativas.En último lugar realizamos un análisis comparativo con razas inglesas(Angus, Hereford y Red Angus) que se caracterizan por un menor creci-miento y mayor grado de engrasamiento que las nuestras, pero a las que seles atribuye en cambio un elevado nivel de terneza. Los resultados obteni-dos muestran que existen diferencias estadísticamente significativas para elsitio CAPN1H entre ambos grupos de razas, con un mayor porcentaje de ale-los favorables para la terneza en el caso de las razas inglesas (alelo C delgen CAPN1D y G del gen CAPN1H). En cambio las frecuencias de los alelospara el gen CAST muestran un porcentaje superior para el alelo C (relacio-nado con la terneza) en el caso de las razas españolas siendo las diferenciasestadísticamente significativas al 95%.CONCLUSIONESSe ha detectado un alto polimorfismo en el gen de la µ-calpaína y la cal-pastatina bovina en las razas autóctonas analizadas, localizándose hasta 7sitios no descritos previamente en otras razas (5 en la subunidad s1 del genCAPN1 y 2 en la s2 del mismo gen). Aunque es necesario un estudio pobla-155cional más amplio para determinar su efecto, especialmente de los SNPs nodescritos previamente, los análisis llevados a cabo por otros organismos nor-teamericanos (Meat Research Center, Clay Center) indican su adecuaciónpara la selección y mejora de la terneza de la carne (selección asistida pormarcadores). El análisis comparativo de los 3 sitios previamente descritos, determinauna situación de partida muy adecuada para las 3 razas maternales ligadasa la dehesa (Retinta, Avileña y Morucha), las cuales presentan una frecuen-cia en la mayor parte de los casos significativamente superior en los sitios5709, 4558 del gen CAPN1 y 282 del gen CAST de los alelos más favorablesrelacionados con una mayor terneza instrumental en comparación con elresto de razas analizadas. Las razas maternales no seleccionadas y las dedoble aptitud europeas poseen unas frecuencias de presentación de los ale-los favorables sensiblemente inferior a las de las autóctonas de fomento adiferencia de las razas inglesas cuya situación es superior a la de nuestrasrazas mejoradas de la dehesa. Con respecto a las razas especializadas con-tinentales nos encontramos con unas frecuencias de presentación alélicasimilares a las del conjunto de Retinta, Avileña Negra-Ibérica y Morucha.Finalmente se recomienda la introducción como un criterio de selecciónañadido, del genotipo del gen CAST, y de forma secundaria el del genCAPN1D.AGRADECMIENTOSEste trabajo ha sido financiado por la Dirección General de Ganaderíadel MAPA a través del estudio técnico “Detección de la variabilidad dedeterminados genes y su relación con parámetros de calidad de lacarne en las razas bovinas autóctonas maternales españolas”. Losautores quieren agradecer a la Asociación Española de Criadores de GanadoVacuno Selecto de Raza Avileña - Negra Ibérica y a la Asociación Nacionalde Criadores de Ganado Vacuno de Raza Morucha Selecta su colaboraciónen el presente estudio.REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICASDekkers, J. (2004). Commercial application of marker- and gene-assistedselection in livestock: strategies and lessons. Journal of Animal Science,82 (E. Suppl.), E313–E328.Miller, S. A., Dykes, D. D. and Polesky, H. F. (1988). A simple salting out pro-cedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res.16: 1215.Consejería de Agricultura y Pesca156Innovación tecnológica en el ámbito de la producción animalPage, B.T., Casas, E., Heaton, M.P., Cullen, N.G., Hyndman, D.L., Morris,C.A., Crawford, A.M., Wheeler, T.L., Koohmaraie, M., Keele, J.W. andT.P.L. Smith. (2002). Evaluation of single-nucleotide polymorphisms inCAPN1 for association with meat tenderness en cattle. J. Anim. Sci.80:3077.Schenkel, F. S., Miller, S. P., Jiang, Z., Mandell, I. B., Ye, X., Li, H. andWilton, J. W. (2006). Association of a single nucleotide polymorphism inthe calpastatin gene with carcass and meat quality traits of beef cattle. J.Anim. Sci. 84:291-299.157

Detección de single nucleotide polymorphisms en genes relacionados con la terneza de la carne (capn1 y cast) en las razas bovinas autóctonas españolas

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Detección de single nucleotide polymorphisms en genes relacionados con la terneza de la carne (capn1 y cast) en las razas bovinas autóctonas españolas

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