Alonso-Moraga, A.

Analla, M.

Anter, J.

Muñoz-Serrano, A.

Romero-Jiménez, M.

idUS. Depósito de Investigación Universidad de Sevilla

PERSPECTIVAS DE UTILIZACIÓN DE PLANTAS MEDICINA-LES TRADICIONALES EN QUIMIOPREVENCIÓN.MATRICARIA CHAMOMILLA Y SUS FENOLESAnter J.1, Romero-Jiménez M.1, Analla M.2, Muñoz-Serrano A.1y Alonso-Moraga A.11 Departamento de Genética, Universidad de Córdoba, Campus de Rabanales,14071 Córdoba, Spain.2 Département de Biologie, Université Abdelmalek Essaâdi, Faculté de Sciences,B.P.2121, 93002 Tétouan, Morocco.Correo de contacto: ge1almoa@uco.esINTRODUCCIÓNLas plantas medicinales representan la mayor fuente de principios activosutilizados para extraer nuevas moléculas utilizados hoy día por las empresasfarmacéuticas.La manzanilla es una planta medicinal muy conocida y utilizada desdeantiguo. Es una hierba muy apreciada que crece en terrenos secos y solea-dos, en márgenes de caminos y sembrados de la mayor parte de Europa.Los principios activos de la manzanilla son los responsables de conferirlenumerosas propiedades. Entre ellos se encuentran: aceite esencial, flavo-noidos, cumarinas… y sales minerales (8-11%). Los extractos de esta plan-ta exhiben muchas actividades: antiinflamatoria, antiséptica, antiinflamato-ria, analgésica y cicatrizante.Los fenoles son metabolitos secundarios de las plantas que tienen unaactividad antioxidante que les confiere la capacidad de inactivar varias enzi-mas. Los fenoles actúan también inhibiendo los radicales libres, la iniciación,la promoción y la progresión de tumores. Los fenoles mayoritarios de lamanzanilla son la Apigenina y el Bisabolol. La Apigenina y el Bisabolol inhi-159ben la promoción de los tumores e inducen la apoptosis en células cancero-sas. La utilización de ensayos de citotoxicidad y genotoxicidad a corto plazoconstituye un medio eficaz y rápido para la evaluación de las actividades delas moléculas (simples o complejas) susceptibles de ser tumoricidas, geno-tóxicas o antigenotóxicas.El objetivo de este trabajo es la evaluación de las actividades genotóxi-ca, antigenotóxica y citotóxica de extractos de manzanilla y de dos de susfenoles mayoritarios (Apigenina y Bisabolol). Para ello, hemos utilizado dosaproximaciones: el test de mutaciones y recombinaciones somáticas enDrosophila melanogaster y el ensayo de crecimiento y viabilidad en célulasde leucemia humana HL-60.MATERIAL Y MÉTODOSSe usaron dos tipos de presentación de muestra de M. chamomilla : infu-siones de la planta, preparada hirviendo bolsas comerciales, y la planta com-pleta pulverizada con nitrógeno líquido y tamizada. Los fenoles mayoritariosde la manzanilla fueron adquiridos en Sigma y filtrados previamente.1-Test de mutaciones y recombinaciones somáticas de Drosophila(SMART)Se han usado las siguientes líneas de Drosophila melanogaster, con mar-cadores genéticos en el brazo izquierdo del cromosoma 3:1.- flr3/In(3LR)TM3, ri pp sep bx34e es Bdx (abreviadamente flr3/TM3,Bds). 2.-mwh/mwh, Este ensayo esta basado el la perdida de heterocigosidad para estos dosmarcadores, lo que se traduce fenotípicamente en la aparición de pelosmutados al nivel de las alas de Drosophila (Graf, 1984). Las pruebas degenotoxicidad fueron llevadas a cabo siguiendo el protocolo general de Graf.Larvas heterocigóticas de 72h se transfirieron a viales de tratamiento con lasdiferentes concentraciones de la sustancia a ensayar. Los tests de antige-notoxicidad fueron realizados añadiendo el agente mutagénico (Peróxido deHidrógeno) a diferentes concentraciones fisiológicas de los extractos de M.chamomilla y sus fenoles.Después de emerger, sólo los adultos transeheterocigotos mwh/flr3 semontan en portas y analizados al microscopio fotónico. Los resultados deltest SMART se expresan como frecuencia relativa del número de manchaspor ala. El análisis de los datos esta basado en la comparación de las fre-Consejería de Agricultura y Pesca160Innovación tecnológica en el ámbito de la producción animalcuencias observadas entre las series tratadas y los controles. Se utilizó unprocedimiento de multidecisión para determinar si los resultados eran posi-tivos, negativos o por el contrario no se podían establecer conclusionesdependiendo de la frecuencia con la que se presentaban las manchas en lasalas (Frei and Würgler, 1988). En este trabajo se utilizó el test X2 para com-parar los controles y los tratados.2-Test de inhibición del crecimiento tumoralPara la evaluación de la citotoxicidad se utilizó el ensayo de crecimientoy viabilidad celular en células de leucemia humana HL-60. Se establecieroncultivos con 100.000 células/ml, en cuyo medio de cultivo se había disueltoa diferentes concentraciones el extracto de M. chamomilla y su infusión. Lasconcentraciones de los fenoles abarcaban las concentraciones a las que seencuentran en la planta.La actividad tumoricida de las diferentes plantas y compuestos fenólicosfue determinada siguiendo el crecimiento de los cultivos celulares durante72h, usando una coloración diferencial con azul de tripán para diferenciar lascélulas vivas de las muertas.RESULTADOS Y DISCUSIÓNLos resultados obtenidos en el estudio de genotoxicidad de Matricariachamomilla y de sus fenoles mayoritarios (Apigenina y Bisabolol) muestranque tanto los extractos como los fenoles no son genotóxicos en SMART a ladosis más baja probada. Con respecto a los resultados de antigenotoxicidadse ha visto que esta planta y sus fenoles exhibieron unos claros efectos anti-genotóxicos frente al peróxido de hidrógeno, un agente mutágeno que pro-duce daños en el DNA. Puesto que los tratamientos se realizaron combinan-do al mismo tiempo el mutágeno y las distintas infusiones es apropiadointerpretar la reducción de las tasas de mutación como efecto desmutagéni-co (Romero-Jiménez, 2005). Los efectos antioxidantes de los extractosacuosos de M. chamomilla se conocen bien y se relacionan con su conteni-do fenólico (Trouillas, 2003); su efecto desmutagénico podría ser debido,entre otros, a un compuesto como el µ-Bisabolol, o la Apigenina con activi-dad antitumoral o al conjunto de los fenoles de esta planta. Su aceite resul-to antigenotóxico en el análisis de intercambio entre cromátidas hermanas(Hernadez-Ceruelos, 2002).Los resultados de inhibición obtenidos se pueden explicar por un siner-gismo entre su contenido fenólico y el peróxido de Hidrógeno debido a lacapacidad de los fenoles de atrapar especies reactivas de oxígeno como se161ha observado en experimentos anteriores realizados con fenoles contenidosen el aceite de oliva virgen extra (Campos Sánchez, 2003).Los resultados de crecimiento relativo respecto al control de células HL-60 tratadas tanto en infusión como en planta completa, se presentan en lasfiguras (). Observamos que todas afectan al crecimiento tumoral de formaque lo inhiben, originando unas curvas típicas de inhibición del crecimientocelular. Se ve que M. chamomilla inhibe la proliferación de las células HL-60,siendo la DL50 en planta completa aproximadamente 10 veces mayor queen la infusión. Sus extractos acuosos no son capaces de inhibir la prolifera-ción de células de melanoma de Ratón (Trouillas, 2003). Respecto a suscomponentes, el µ-Bisabolol induce apoptosis en células de glioma de rata(Carretero, 2001) y la Apigenina es citotóxica para células cancerosas ytumoricidas de células de la piel en ratón e inhibe el crecimiento de fibro-blastos y la agregación paquetería (Harbone, 2000). Por tanto, las presen-taciones de la muestra en infusión y planta completa usadas por nosotros síson eficaces frente a células cancerosas HL-60 y sugerimos que su conteni-do en µ-Bisabolol y Apigenina podría ser la causa de su actividad citotóxica.Consejería de Agricultura y Pesca162Innovación tecnológica en el ámbito de la producción animalFigura 1. Resultados de genotoxicidad y antigenotoxicidad.163Bisabolol0,80,70,60,50,40,30,20,10Clones totales /alaControl negativoTrat Simple 0,01250,1Control positivoTrat Combinado 0,1250,1Control negativoControl positivoPretrat. en Peróxido de H 0,1250,1Control negativoContro positivoPretrat. en Apigenina 0,1250,1Matricaria  chamomilla1,210,80,60,40,20Clones totales /alaControl Control       Tratamiento     Tratamientonegativo          positivo     Simple 16,18   Combinado 8,090,12 M         mg/ml            mg/mlApigenina2,221,81,61,41,21,0,80,60,40,20Clones totales /alaControl negativoTrat Simple 0,0250,1Control positivoTrat Combinado 0,0250,1Control negativoControl positivoPretrat. en Peróxido de H 0,0250,1Control negativoContro positivoPretrat. en Apigenina 0,0250,1Figura 2. Inhibición del crecimiento tumoral de células HL60 a las 72 horaspor: A) infusión de Matricaria chamomilla, B) Extracto de Matricaria chamo-milla, C) Apigenina, D) Bisabolol.Consejería de Agricultura y Pesca164Inhibición del Crecimiento Tumoral alas 72 horasA1009080706050403020100Crecimineto Tumoral %0   0,5    1    1,5    2     2,5    3    3,5Concentración de Matricariachamomilla infusión (mg/ml)BC D1009080706050403020100Crecimineto Tumoral %0   2    4    6    8   10   12  14 16  18Concentración de Matricaria chamomilla planta (mg/ml)0  0,01  0,02  0,03  0,04  0,05 0,06Concentración de Bisabolol (mg/ml)0  0,01  0,01  0,02 0,02 0,03 0,03Concentración de Apigenina (mg/ml)Inhibición del Crecimiento Tumoral alas 72 horasInhibición del Crecimiento Tumorala las 72 horasInhibición del Crecimiento Tumorala las 72 horas100806040200Crecimineto Tumoral %100806040200Crecimineto Tumoral %Innovación tecnológica en el ámbito de la producción animalREFERENCIAS BIBLIOGRÁFICASCampos Sánchez, J. 2003. 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Perspectivas de utilización de plantas medicinales tradicionales en quimioprevención. Matricaria chamomilla y sus fenoles.

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