Glutamina sintetasa de la cianobacteria unicelular synechocystis sp. PCC 6803: Purificación, estudios de su regulación por la fuente de nitrógeno y clonación del gen glnA
Las cianobacterias, organismos procariotas fotosintéticos, asimilan el amonio principalmente por la acción secuencial de las enzimas Glutamina Sintetasa y Glutamato Sintasa (ruta GS-GOGAT), de las cuales es la Glutamina Sintetasa (GS) la que experimenta una regulación de su actividad. Se ha purificado a homogeneidad la GS de Synechocystis sp. PCC 6803. La enzima pura presenta una actividad específica de 143 u/mg proteína y está compuesta por un solo tipo de subunidad de 52 KDA. La actividad biosintética de la enzima es dependiente de MG2+ y se ve inhibida por ADP y AMP principalmente. Los estudios inmunológicos de las GSS de Synechocystis PCC 6803, Synechococcus PCC 6301 y Calothrix PCC 7601 demuestran el alto grado de conservación de esta enzima dentro de las cianobacterias. La actividad GS de Synechocystis está regulada por la fuente de nitrógeno, encontrándose la enzima activa cuando la fuente es nitrato e inactiva en un 90% cuando dicha fuente es amonio. El control de esta regulación parece estar ejercido por el balance en la concentración intracelular de compuestos carbono- nitrogenados frente a compuestos carbonados. Proponemos que este control puede ser ejercido por el balance intracelular de Glutamina y 2-Oxo-Glutarato. La regulación de la Glutamina Sintetasa de Synechocystis se lleva a cabo también a nivel de síntesis de la proteína, siendo los niveles de proteína GS cuando la fuente de nitrógeno es nitrato el doble que cuando es amonio. La perdida de actividad GS no parece ser debida a la modificación covalente de la enzima. Proponemos que dicha inactivación está provocada por la unión no covalente de un compuesto fosforilado. Se ha clonado el gen estructural de la GS, glnA, de Synechocystis mediante hibridación heteróloga con un fragmento del gen glnA de la Cianobacteria Anabaena PCC 7120. El gen complementa la auxotrófia de Glutamina de un mutante de Escherichia coli carente de actividad GS. En este trabajo presentamos la caracterización de la Glutamina Sintetasa de la cianobacteria unicelular Synechocystis PCC 6803, describiendo su purificación, principales características cinéticas y respuesta a la presencia de distintos compuestos relacionados con el metabolismo del nitrógeno. Asimismo presentamos un estudio sobre la regulación de la actividad y síntesis de dicha enzima en respuesta al tipo de fuente de nitrógeno disponible para el organismo. Por otro lado, presentamos la clonación del gen glnA de esta cianobacteria y describimos la obtención de una estirpe, AM 6, derivada de Synechocystis que presenta integrado en su cromosoma el gen glnA de Anabaena PCC 7120. La clonación del gen permite el estudio de una seria de interesantes cuestiones acerca de la estructura y regulación de esta enzima y junto con la estirpe AM 6, puede servir en el estudio de las diferencias existentes en la regulación de la GS de Anabaena PCC 7120 y Synechocystis PCC 6803