Instrumentos que permitem a medição e transferência precisa e rigorosa de líquidos.N/

Marques-Ramos, Ana

Repositório Científico do Instituto Politécnico de Lisboa

Workshop de Pipetagem Ana Ramos Coelho, Ph.D. 1 Ana Ramos Coelho, ESTeSL, Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa, Instituto Politécnico de Lisboa, Av. D. João II, Lote 4.69.01, 1990-096 Lisboa, Portugal, ana.ramos@estesl.ipl.pt  2 H&TRC - Centro de Investigação em Saúde e Tecnologia      25 de fevereiro de 2019 Instrumento que permite a medição e transferência precisa e rigorosa de líquidos Tipos de Pipetas  - Pipetas de pasteur  - Pipeta volumétrica  - Pipeta graduada  - Micropipeta  Tipos de micropipetas  - almofada de ar que é deslocada dentro da pipeta por um pistão durante a aspiração Tipos de micropipetas  - Funciona como seringa para aspirar e dispensar a amostra   - Líquidos viscosos e líquidos voláteis. Técnica pipetagem  pipeta deslocamento de ar Preparação pipetagem  1. Agarrar a pipeta gentilmente  2. Selecionar volume:  Rodar 180ºC acima do Vpretendido e  rodar novamente posição correcta  3. Colocar ponta  4. Pré-equilibrar a ponta  3 etapas principais  2- Aspirar  3- Dispensar  1- Colocar ponta Pipetagem directa - Ciclo de Pipetagem   Pipetagem Directa  • Soluções aquosas (tampões, ácidos, bases) Pipetagem Repetitiva  Pipetagem reversa- Ciclo de Pipetagem   Pipetagem Reversa   • Soluções viscosas, densas, voláteis.  Pipetagem de soluções viscosas  Pipetas e volumes  – P2: 0.2 μL – 2 μL – P10: 1 μL – 10 μL – P20: 2 μL – 20 μL – P100: 10 μL – 100 μL – P200: 20 μL – 200 μL – P1000: 100 μL – 1000 μL Pipetas e volumes  1,52 μL 15,2 μL 152 μL 520 μL Volume apropriado  - Pipetar entre 10 a 100% do volume nominal (idealmente 35-100%)  Ângulo de pipetagem vs Manter pipeta vertical – aumenta precisão e exactidão até 2.5%                    Aspirar                                       Dispensar 10º- 45º parede reservatório Profundidade de imersão da ponta Ponta deve ultrapassar a superfície do líquido Taxa de aspiração  • Amostra contacta com o eixo, danificando o pistão  • Introdução de aerossóis  • Contaminação entre amostras  Pipetas macro-volume:  • Aguardar 1 seg antes de remover a ponta Dispensa do líquido  Recomendações para pipetar líquidos  1. Verificar se pipeta se encontra limpa  2. Utilizar pontas uma única vez  3. Não virar a pipeta quando ponta contém líquido  4. Evitar contaminações: ejector ponta  5. Manter as pipetas na vertical  Escolha da Ponta adequada  1. Ponta standard sem filtro: pipetagem comum  2. Ponta com filtro: PCR, estudos forenses e amostras com radioisotopos.  3. Ponta alongada: evita contaminação entre amostras e da pipeta.  4. Ponta de aplicação de amostras em gel  5. Ponta solvent-safe: soluções caústicas e corrosivas  Escolha da Ponta adequada   Dicas para aumentar a precisão   1. Pré-equilibrar a ponta antes de pipetar  2. Equilibrar o líquido e a pipeta à TA  3. Verificar se a ponta tem gotas  4. Adequar a técnica de pipetagem ao tipo de líquido  5. Fazer pausas consistentes Dicas para aumentar a precisão   6. Manter a pipeta na vertical durante a aspiração  7. Minimizar a manipulação da pipeta e da ponta  8. Mergulhar a ponta de forma adequada na amostra  9. Utilizar a ponta adequada  10. Premir o botão de pipetagem com força e rapidez consistentes Pipeta de deslocamento de ar vs pipeta de deslocamento positivo Pipeta de Deslocamento positivo   Para amostras viscosas, densas e voláteis.   Não depende da TA, pressão atmosférica ou humidade.   Exactidão e precisão mais facilmente alcançáveis   Não contaminação ou dano do sistema capilar descartável  X Sistema capilar + pistão caros  X Requer força ergonómica superior  Pipeta de Deslocamento positivo  2- Aspirar  3- Dispensar  1- Colocar pistão Escolha da Pipeta Escolha da Pipeta Fontes de erro comuns   1. Bolhas de ar  2. Líquido no exterior da pipeta  3. Contaminação amostras  4. Aquecimento da pipeta  Redução dos factores de risco da pipetagem   - Ambiente: posição do equipamento circundante que permita postura correcta.  - Postura: correcto posicionamento do corpo.  - Força: redução da força utilizada para colocar e ejectar a ponta e pipetar.  - Repetição: Número limite de movimentos de pipetagem. Limpeza das pipetas  • Seguir instruções do fabricante • Limpar com etanol 70% diariamente • Limpar o interior • Limpar solventes orgânicos com detergentes • Eliminar DNA: imergir partes pipeta em 3% (p/v) hipoclorito de sódio , 15 min. Lavar bem com água destilada e deixar secar.  • Autoclavagem, de acordo com instruções fabricante   Calibração  Diferença entre volume dispensado e volume selecionado     Definição dos limites de erro pela ISSO 8655  Calibração 1. Verificar o volume nominal  2. Verificar o volume mínimo ou 10% do Volume nominal 3. Utilizar uma ponta pré-equilibrada (3-5x)  4. Realizar 10 pipetagens de ambos os volumes 5. Verificar se o volume dispensado está dentro dos limites definidos Calibração pelo método gravimétrico  Baseada na determinação do peso de amostras de água  - Temperatura de 21.5 ± 1.5ºC - Humidade relativa 50%-75%  Equipamento: - Termómetro calibrado (erro máx 0.2ºC) - Higrómetro (erro máx 10%) - Barómetro (erro máx 0.5 KPa) - Água destilada Calibração pelo método gravimétrico  - Balanças      - Tubos/frascos Calibração pelo método gravimétrico  1. Peso para volume     1. Colocar água destilada num recipiente de pesagem 2. Registar condições (TA, T água, humidade relativa, pressão barométrica) 3. Selecionar o volume em teste na pipeta 4. Colocar ponta 5. Pré-equilibrar ponta 6. Pipetar água 7. Abrir porta balança, retirar recipiente de pesagem, colocar amostra e colocar na balança. Fechar a porta.  Procedimento  8. Depois de estabilizar – registar peso. 9. Repetir 9x 10. Para amostras ≤ 50 μL, estimar a perda por evaporação, ao repetir passos 6-7, sem adicionar a amostra. Registar valores (ei) e repetir (m). 11. Registar condições 12. Determinar Z 13. Calcular exactidão e precisão e comparar com especificações fabricante ou ISSO 8655-2 Procedimento Cálculo da exactidão e precisão              Exactidão                                   Precisão Manutenção  Diária - Verificar se tem sujidades - Manter posição vertical   Periódica - Limpeza a cada 3 meses: desmontar pipeta e verificar calibração - Pipetagem de solventes orgânicos: abrir parte inferior da pipeta e deixar ao ar ON - Pipetagem frequente de ácidos ou bases: lubrificar pistão - Utilizar pontas com filtro Verificação em 2 minutos Prevenção de contaminação  EPIs Bata, luvas, óculos, máscara.   Pipeta-para-amostra - Utilização de pontas com filtro. - Mudança de ponta depois de pipetar cada amostra. - Limpeza da pipeta regular.   Prevenção de contaminação  Amostra-para-pipeta - Manter a pipeta na vertical durante a pipetagem. - Libertar o botão de pipetagem suavemente. - Para evitar contaminação por aerossois: pontas com filtro ou pipeta de deslocamento positivo.  Amostra-para-amostra - Mudar a ponta em cada amostra. - Suspeita de contaminação da pipeta: limpar pipeta e autoclavar. Descontaminação   ThermoScientific Esterilização e desinfecção  - Autoclavagem: 20min a 121ºC  - Desinfectantes ou esterilizantes químicos   Pipetas Serológicas  - Etapas da Pipetagem com pipetas serológicas:   1. Preparação do pompete + pipeta  2. Aspiração da solução  3. Dispensa da solução  Válvula de ar Válvula de sucção Válvula de expulsão 

Workshop de pipetagem

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