José Augusto Pereira

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Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar - ICBAS-UP
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Departamento de Química
José Augusto Pereira
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Introdução à cinética enzimática. Cinética da catálise pela
invertase.
Termodinâmica MIB (2015)
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 Todas as enzimas são proteínas e são portanto lábeis, podendo ser inactivadas e
desnaturadas. Distinguem-se das outras proteínas pelas propriedades catalisadoras, isto é,
pela possibilidade que têm de aumentar milhares de vezes a velocidade de reacções quími-
cas que, na ausência de um catalisador, seriam extremamente lentas.
A velocidade de uma reacção catalisada enzimaticamente depende de muitos factores
e o conhecimento da cinética de uma reacção é importante para a caracterização da respec-
tiva enzima porque oferece pistas sobre o seu comportamento “in vivo” e permite prever o
seu mecanismo de acção.
A mais simples reacção enzimática pode ser representada da seguinte forma:
em que E é a enzima livre, S é o substrato da reacção, P é o produto e ES é o complexo enzima-
substrato. Pode demonstrar-se que, quando [S]>>[P] (início da reacção) e quando [ES] é cons-
tante (estado estacionário), a equação da velocidade inicial da reacção, v0, é dada pela ex-
pressão conhecida como equação cinética de Michaelis-Menten:
v0  =  vmax [S] / (KM + [S]) (1)
em que KM é a constante de Michaelis-Menten,
KM  =  (k –1 + k2) / k1 (2)
e vmax é a sua velocidade máxima que depende da constante de velocidade k2:
vmax  =  k2 [E]total (3)
Esta velocidade máxima é atingida quando a proporção [S]/[E] atinge valores suficientemen-
te grandes para saturar a enzima, ou seja, para fazer com que todas as moléculas de enzima
se encontrem ligadas ao substrato ([ES] = [E]total). Os parâmetros KM e k2 são característicos
de cada reacção enzimática e de cada enzima.
Se representarmos graficamente a velocidade de uma reacção catalisada enzimatica-
2mente em função da concentração do substrato obtém-se um gráfico como o esquematizado
na Figura 1.
v
[S] 
vmax
vmax/2
Km
Figura 1- Representação gráfica da velocidade de uma reacção enzimática em função da concentração de
substrato (Equação 1). A saturação da enzima com elevadas concentrações de substrato conduz à independên-
cia da velocidade da reacção relativamente à concentração de substrato. O valor de KM coincide com o da
concentração de substrato para a qual a velocidade da reacção é exactamente metade da velocidade máxima.
Quando se faz o estudo experimental de uma enzima é difícil averiguar se os dados
experimentais obedecem ou não à equação de Michaelis-Menten, isto é, se a relação entre a
velocidade da reacção e a concentração é definida ou não pela equação da hipérbole rectan-
gular. Para além disso, para se conhecer o valor de KM seria necessário conhecer o valor da
velocidade máxima, o que nem sempre é fácil. Lineweaver e Burk propuseram que se utili-
zassem nos gráficos os valores inversos daqueles que aparecem na equação de Michaelis-
Menten, ou seja:
1/v = 1/vmax + (KM/vmax)(1/[S]) (4)
Se se representar graficamente 1/v em função de 1/[S], e a cinética da enzima for de
Michaelis-Menten, então obtém-se uma recta cujo declive é KM/vmax e cuja ordenada na
origem é 1/vmax, sendo 1/KM a abcissa do ponto da recta cuja ordenada é nula (Figura 2). Esta
representação da equação de Michaelis-Menten é de utilização prática porque permite fazer
um ajuste da função teórica aos dados experimentais através de uma simples regressão
linear.
31/v
1/[S] 
1/vmax
declive =
Km/vmax
-1/Km
Figura 2 - Representação gráfica de Lineweaver-Burk da equação de Michaelis-Menten (Equação 4).
Medidas de actividade enzimática
A actividade enzimática é definida pelo consumo de uma certa quantidade de substra-
to, ou a produção de uma certa quantidade de produto, por unidade de tempo:
actividade enzimática  =  -d[S]/dt  =  d[P]/dt (5)
De acordo com as unidades usadas para a actividade enzimática e para o tempo podem defi-
nir-se as seguintes unidades de actividade enzimática:
Unidade Internacional: 1 U.I.  =  1 mmol de substrato/minuto a 25 ºC
Katal: 1 Kat  =  1 mol de substrato/seg a 37ºC
Estas unidades podem definir a actividade de uma determinada enzima sem haver
necessidade de a isolar, pois nelas não se refere a concentração da própria enzima. Como a
purificação de qualquer enzima é, normalmente, difícil, as medidas de actividade enzimática
já referidas servem para definir precisamente o grau de purificação da enzima nas várias
etapas do processo de isolamento. Ao dividir o valor da actividade enzimática encontrada
numa solução pelo número de miligramas de proteína nela existente, define-se um novo
conceito: a actividade específica. A medida da actividade específica é máxima quando a enzima
se encontra pura.
Cinética da invertase
Reacção
A invertase é uma enzima que catalisa a hidrólise da sacarose segundo a reacção:
sacarose  +  H2O    D-glucose  +  D-frutose (1)
Esta é uma reacção praticamente completa, dita “irreversível” em que os produtos da reac-
ção são D-glucose e D-frutose em quantidades equimoleculares. É de notar que a hidrólise da
sacarose acontece por mecanismos não catalíticos. Embora a velocidade desses mecanis-
mos seja negligenciável, a temperaturas próximas da ambiente, às quais decorrem as expe-
4riências de reacção enzimática, isso já não é verdade a 100 ºC. A hidrólise da sacarose a
altas temperatruras é por isso relevante para o método de doseamento dos produtos da reac-
ção 1 tal como explicado a seguir.
Doseamento
Para determinar a evolução de uma reacção é necessário medir as quantidades de
reagentes gastos, ou de produtos formados, em vários intervalos de tempo. Neste trabalho
prático é usado um método espectrofotométrico de doseamento específico para os produtos
glucose e frutose que se baseia na sua oxidação quantitativa, a 100 ºC, pelo DNS (ácido 3,5
dinitro-salicílico), originando uma solução corada cuja absorvância a 540 nm é proporcional
à soma das concentrações de glucose e frutose. A relação entre concentração e absorvância,
Equação 6, é determinada previamente por regressão linear, usando um método igual ao
deste protocolo, mas com soluções padrão de glucose, ou frutose, com concentrações no in-
tervalo 0 < c < 0,010 M, para os quais se obtêm absorvâncias no intervalo 0 < Abs540 < 0,8:
A540  =  ε540 ([glucose] + [frutose]) L + oo (6)
onde A540 é a absorvância medida a 540 nm, ε540 é a absortividade molar (M
–1
 cm
–1
) directa-
mente estimada pelo declive da regressão, uma vez que L é 1 cm de espessura da solução, e
oo é a ordenada na origem também estimada pela regressão para concentração zero de
monossacarídeos. Uma vez que ε540 e oo dependem da temperatura, é importante anotar a
temperatura a que foram determinados este parâmetros.
É de notar que as soluções para tempo zero usadas como brancos no protocolo cinético
contêm sacarose. Isto é necessário devido à presença de grande excesso de sacarose nas
amostras cinéticas a dosear, que se poderá hidrolisar quando a solução com DNS for aquecida
a 100 ºC. Desta forma, a glucose e a frutose que se poderá formar não-enzimaticamente
neste passo do trabalho aparecerá tanto nas amostras como nos brancos e é descontada
automaticamente nas leituras de absorvância das amostras, sendo doseados apenas os
monossacarídeos provenientes da reacção enzimática.
A invertase
A enzima invertase é obtida com eficácia da levedura Saccharomyces cerevisiae que
produz uma forma intracelular mais leve (~135 kDa) e outra extracelular mais pesada con-
tendo uma porção importante de carboidratos (glicoproteína, 270 kDa). A invertase possui
um pH isoelétrico de cerca de 4 e exibe um máximo de actividade catalítica a pH próximo de
4,5. Por esta razão as soluções de enzima e de sacarose contêm NaH2PO4 0,1 M. Em princípio,
a espécie anfiprótica H2PO4
–
 
 
estabelece um pH de (pKa1+pKa2)/2 = (2.15+7.20)/2 = 4.7 em
água pura. No entanto, devido ao ácido carbónico dissolvido em água, e uma vez que a espé-
cie H2PO4
–
 
 
não constitui um tampão, o pH real é normalmente entre 4.4 e 4.5. Como a
concentração de enzima é de ordem nanomolar (10
–9
 M) nas soluções reaccionais deste tra-
5balho, e como os compostos da reacção 1 não possuem propriedades ácido-base e a reacção 1
não envolve H
+
, é esperado que o pH não varie durante a reacção e que portanto a actividade
da enzima se mantenha constante.
Determinação das velocidades iniciais, v
0
Para determinar a velocidade inicial (v0) da reacção de hidrólise é necessário adicio-
nar a uma solução de sacarose uma certa quantidade da enzima invertase, em concentra-
ções tais que não não saturem a enzima. Desta solução são então retiradas alíquotas aos
tempos 0, 1, 2, 3, 4 e 5 minutos às quais é adicionada solução de DNS. Esta solução pára a
reacção, por inactivação da enzima, e permite dosear os produtos formados para cada um
desses tempos. O declive da regressão linear aplicada aos dados ([glucose], tempo) é a veloci-
dade média da reacção nos seus primeiros 5 minutos, velocidade essa que se considera
constante e uma boa aproximação da velocidade inicial (Figura 3). Para mostrar que assim é
considera-se a expressão da cinética de Michaelis-Menten que descreve a variação da con-
centração de produto com o tempo, isto é, o integral da Equação 1:
t vmax  =  [P] + KM ln(1+ [P]/([S]0–[P])) (7)
onde [S]0 é a concentração de substrato (sacarose) no tempo zero e [P] é a concentração de
produto (glucose, por exemplo) no tempo t. A Figura 3 mostra como a variação de [P] não é
linear com o tempo. No entanto, no início da reacção, verifica-se que [S] >> [P] o que, dado que
ln(1+x) ≈ x, se x << 1, permite eliminar o logaritmo da equação 7 para obter uma forma válida
para os primeiros instantes da reacção:
t vmax  ≈  [P] + KM [P]/([S]0–[P]) (8)
Reorganizando os termos em ordem a [P], esta equação pode ser expressa na forma
[P]  ≈  t vmax [S]0 / (KM + [S]0) (9)
Figura 3 - Evolução com o tempo das concentrações durante uma reacção enzimática com cinética de Michaelis-
Menten.
6o que mostra haver, no início da reacção, uma relação linear entre [P] e o tempo, dependendo
apenas da constante vmax [S]0 / (KM + [S]0). Não é coincidência que esta constante tenha a
forma da Equação 1 pois diferenciando a Equação 9 obtém-se
∆[P]  ≈  ∆t vmax [S]0 / (KM + [S]0)    <=>
∆[P]/∆t  ≈  vmax [S]0 / (KM + [S]0)  =  v0 (10)
A equação 10 mostra que a velocidade instantânea inicial (em rigor quando t = 0) é
aproximadamente constante durante o intervalo ∆t se [P] << [S], ou seja, a velocidade média
durante os primeiros instantes de uma reacção que se inicia só com sacarose e enzima é
uma boa aproximação da velocidade inicial e será tanto melhor quanto menor puder ser ∆t.
Determinação de K
M
 e k
2
 da invertase
De posse de valores para v0 em função de [S]0 é possível por regressão não linear da
equação 1, ou regressão linear da equação 4, obter os parâmetros da enzima KM e vmax. A
regressão não linear é de preferir por proporcionar uma estimativa directa das incertezas
associadas aos parâmetros.
Sabendo vmax e a concentração de enzima usada é possível calcular a constante k2
através da equação 3.
Variação de k
2
 com a temperatura
Os dados de k2 em função da temperatura permitem estimar os valores de entalpia e de
entropia de activação aparentes do passo [ES] -> E + P por regressão não linear da equação de
Eyring, correspondente à teoria do estado de transição:
k2  =  (kBT/h) exp(–∆G
‡
/(RT))  =  (kBT/h) exp(–∆H
‡
/(RT)) exp(∆S‡/R) (11)
ou por regressão linear da sua forma logarítmica
ln(k2/T)  =  (–∆H
‡
/(RT)) + (∆S‡/R) + ln(kB/h) (12)
onde kB é a constante de Boltzman, h é a constante de Planck, T é a temperatura em Kelvin,
R é a constante dos gases ideais e ∆H‡, ∆S‡ e ∆G‡ são, respectivamente, variação de entalpia,
variação de entropia e variação de energia de Gibbs padrão de activação. Tal como referido
na sub-secção anterior, também neste caso a regressão não linear é de preferir por proporci-
onar uma estimativa directa das incertezas associadas aos parâmetros.
Protocolo laboratorial
Material
Tubos de ensaio
Pipetas automáticas
Vortex
Banho-maria
7Cronómetro
Pipeta de 10 cm
3
Espectrofotómetro
Agitadores magnéticos
Placa de aquecimento
Gobelés
Gelo
Suportes para tubos de ensaio
Reagentes
Solução de NaH2PO4 0,1 M
Solução de invertase
(Sigma-Aldrich I4504, MM = 270 x 10
3
 g/mol, 1,00 g dm
–3
 em NaH2PO4 0,1 M)
Reagente de DNS (contendo ácido dinitrosalicílico a 10 g dm
–3
, isto é, 0,044 mol dm
–3
)
Água desionizada
Soluções de sacarose 0,010, 0,025, 0,050 e 0,080 M em NaH2PO4 0,1 M
Técnica
1. Identificar cada um dos gobelés de 50 cm
3
 das soluções de sacarose com as letras A,
B, C e D. Manter os gobelés num banho de água a temperatura constante. Informe-se
junto do docente sobre a temperatura a estabilizar (usar gelo e água quente conforme
necessário).
2. Para cada solução de sacarose, utilizar seis tubos de ensaio que deve codificar de 0x
a 5x, em que x é a letra de código dessa solução de sacarose, A, B, C ou D.
3. Pipetar, com pipeta automática, 1 cm
3
 do reagente DNS para todos os tubos de ensaio
referidos em 2.
4 - Retirar, com pipeta automática, 1 cm
3
 de cada uma das soluções de sacarose para
cada um dos tubos zero (“brancos”).
5 - Pipetar, com pipeta automática, 1 cm
3
 da solução da enzima e adicioná-la ao gobelé
que contém a solução de sacarose 0,010 M, desencadeando simultaneamente o cronó-
metro e agitando com uma vareta de vidro durante alguns segundos para homogeneizar
a mistura.
6 - Uns segundos antes do minuto 1, recolher, com pipeta automática, uma amostra de
1 cm
3
 da solução contida no gobelé. Exactamente ao minuto 1 despejar a amostra direc-
tamente para o fundo do tubo de ensaio 1 referente a esta concentração de sacarose.
Agitar o tubo de ensaio no vortex e voltar a colocá-lo no suporte.
7 - Repetir a operação descrita em 6 para os minutos 2, 3, 4 e 5.
8 - Terminados estes ensaios, colocar os tubos de ensaio em banho-maria fervente
durante exactamente 8 minutos. É importante que a água esteja em ebulição quando
os tubos forem colocados no banho.


Portuguese

Introdução à cinética enzimática. Cinética da catálise pela invertase.

Repositório Aberto da Universidade do Porto

1____________________________________________________________________________Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar - ICBAS-UP____________________________________________________________________________Departamento de QuímicaJosé Augusto Pereira____________________________________________________________________________Introdução à cinética enzimática. Cinética da catálise pelainvertase.Termodinâmica MIB (2015)_____________________________________________________________ Todas as enzimas são proteínas e são portanto lábeis, podendo ser inactivadas edesnaturadas. Distinguem-se das outras proteínas pelas propriedades catalisadoras, isto é,pela possibilidade que têm de aumentar milhares de vezes a velocidade de reacções quími-cas que, na ausência de um catalisador, seriam extremamente lentas.A velocidade de uma reacção catalisada enzimaticamente depende de muitos factorese o conhecimento da cinética de uma reacção é importante para a caracterização da respec-tiva enzima porque oferece pistas sobre o seu comportamento “in vivo” e permite prever oseu mecanismo de acção.A mais simples reacção enzimática pode ser representada da seguinte forma:em que E é a enzima livre, S é o substrato da reacção, P é o produto e ES é o complexo enzima-substrato. Pode demonstrar-se que, quando [S]>>[P] (início da reacção) e quando [ES] é cons-tante (estado estacionário), a equação da velocidade inicial da reacção, v0, é dada pela ex-pressão conhecida como equação cinética de Michaelis-Menten:v0  =  vmax [S] / (KM + [S]) (1)em que KM é a constante de Michaelis-Menten,KM  =  (k –1 + k2) / k1 (2)e vmax é a sua velocidade máxima que depende da constante de velocidade k2:vmax  =  k2 [E]total (3)Esta velocidade máxima é atingida quando a proporção [S]/[E] atinge valores suficientemen-te grandes para saturar a enzima, ou seja, para fazer com que todas as moléculas de enzimase encontrem ligadas ao substrato ([ES] = [E]total). Os parâmetros KM e k2 são característicosde cada reacção enzimática e de cada enzima.Se representarmos graficamente a velocidade de uma reacção catalisada enzimatica-2mente em função da concentração do substrato obtém-se um gráfico como o esquematizadona Figura 1.v[S] vmaxvmax/2KmFigura 1- Representação gráfica da velocidade de uma reacção enzimática em função da concentração desubstrato (Equação 1). A saturação da enzima com elevadas concentrações de substrato conduz à independên-cia da velocidade da reacção relativamente à concentração de substrato. O valor de KM coincide com o daconcentração de substrato para a qual a velocidade da reacção é exactamente metade da velocidade máxima.Quando se faz o estudo experimental de uma enzima é difícil averiguar se os dadosexperimentais obedecem ou não à equação de Michaelis-Menten, isto é, se a relação entre avelocidade da reacção e a concentração é definida ou não pela equação da hipérbole rectan-gular. Para além disso, para se conhecer o valor de KM seria necessário conhecer o valor davelocidade máxima, o que nem sempre é fácil. Lineweaver e Burk propuseram que se utili-zassem nos gráficos os valores inversos daqueles que aparecem na equação de Michaelis-Menten, ou seja:1/v = 1/vmax + (KM/vmax)(1/[S]) (4)Se se representar graficamente 1/v em função de 1/[S], e a cinética da enzima for deMichaelis-Menten, então obtém-se uma recta cujo declive é KM/vmax e cuja ordenada naorigem é 1/vmax, sendo 1/KM a abcissa do ponto da recta cuja ordenada é nula (Figura 2). Estarepresentação da equação de Michaelis-Menten é de utilização prática porque permite fazerum ajuste da função teórica aos dados experimentais através de uma simples regressãolinear.31/v1/[S] 1/vmaxdeclive =Km/vmax-1/KmFigura 2 - Representação gráfica de Lineweaver-Burk da equação de Michaelis-Menten (Equação 4).Medidas de actividade enzimáticaA actividade enzimática é definida pelo consumo de uma certa quantidade de substra-to, ou a produção de uma certa quantidade de produto, por unidade de tempo:actividade enzimática  =  -d[S]/dt  =  d[P]/dt (5)De acordo com as unidades usadas para a actividade enzimática e para o tempo podem defi-nir-se as seguintes unidades de actividade enzimática:Unidade Internacional: 1 U.I.  =  1 mmol de substrato/minuto a 25 ºCKatal: 1 Kat  =  1 mol de substrato/seg a 37ºCEstas unidades podem definir a actividade de uma determinada enzima sem havernecessidade de a isolar, pois nelas não se refere a concentração da própria enzima. Como apurificação de qualquer enzima é, normalmente, difícil, as medidas de actividade enzimáticajá referidas servem para definir precisamente o grau de purificação da enzima nas váriasetapas do processo de isolamento. Ao dividir o valor da actividade enzimática encontradanuma solução pelo número de miligramas de proteína nela existente, define-se um novoconceito: a actividade específica. A medida da actividade específica é máxima quando a enzimase encontra pura.Cinética da invertaseReacçãoA invertase é uma enzima que catalisa a hidrólise da sacarose segundo a reacção:sacarose  +  H2O    D-glucose  +  D-frutose (1)Esta é uma reacção praticamente completa, dita “irreversível” em que os produtos da reac-ção são D-glucose e D-frutose em quantidades equimoleculares. É de notar que a hidrólise dasacarose acontece por mecanismos não catalíticos. Embora a velocidade desses mecanis-mos seja negligenciável, a temperaturas próximas da ambiente, às quais decorrem as expe-4riências de reacção enzimática, isso já não é verdade a 100 ºC. A hidrólise da sacarose aaltas temperatruras é por isso relevante para o método de doseamento dos produtos da reac-ção 1 tal como explicado a seguir.DoseamentoPara determinar a evolução de uma reacção é necessário medir as quantidades dereagentes gastos, ou de produtos formados, em vários intervalos de tempo. Neste trabalhoprático é usado um método espectrofotométrico de doseamento específico para os produtosglucose e frutose que se baseia na sua oxidação quantitativa, a 100 ºC, pelo DNS (ácido 3,5dinitro-salicílico), originando uma solução corada cuja absorvância a 540 nm é proporcionalà soma das concentrações de glucose e frutose. A relação entre concentração e absorvância,Equação 6, é determinada previamente por regressão linear, usando um método igual aodeste protocolo, mas com soluções padrão de glucose, ou frutose, com concentrações no in-tervalo 0 < c < 0,010 M, para os quais se obtêm absorvâncias no intervalo 0 < Abs540 < 0,8:A540  =  ε540 ([glucose] + [frutose]) L + oo (6)onde A540 é a absorvância medida a 540 nm, ε540 é a absortividade molar (M–1 cm–1) directa-mente estimada pelo declive da regressão, uma vez que L é 1 cm de espessura da solução, eoo é a ordenada na origem também estimada pela regressão para concentração zero demonossacarídeos. Uma vez que ε540 e oo dependem da temperatura, é importante anotar atemperatura a que foram determinados este parâmetros.É de notar que as soluções para tempo zero usadas como brancos no protocolo cinéticocontêm sacarose. Isto é necessário devido à presença de grande excesso de sacarose nasamostras cinéticas a dosear, que se poderá hidrolisar quando a solução com DNS for aquecidaa 100 ºC. Desta forma, a glucose e a frutose que se poderá formar não-enzimaticamenteneste passo do trabalho aparecerá tanto nas amostras como nos brancos e é descontadaautomaticamente nas leituras de absorvância das amostras, sendo doseados apenas osmonossacarídeos provenientes da reacção enzimática.A invertaseA enzima invertase é obtida com eficácia da levedura Saccharomyces cerevisiae queproduz uma forma intracelular mais leve (~135 kDa) e outra extracelular mais pesada con-tendo uma porção importante de carboidratos (glicoproteína, 270 kDa). A invertase possuium pH isoelétrico de cerca de 4 e exibe um máximo de actividade catalítica a pH próximo de4,5. Por esta razão as soluções de enzima e de sacarose contêm NaH2PO4 0,1 M. Em princípio,a espécie anfiprótica H2PO4–  estabelece um pH de (pKa1+pKa2)/2 = (2.15+7.20)/2 = 4.7 emágua pura. No entanto, devido ao ácido carbónico dissolvido em água, e uma vez que a espé-cie H2PO4–  não constitui um tampão, o pH real é normalmente entre 4.4 e 4.5. Como aconcentração de enzima é de ordem nanomolar (10–9 M) nas soluções reaccionais deste tra-5balho, e como os compostos da reacção 1 não possuem propriedades ácido-base e a reacção 1não envolve H+, é esperado que o pH não varie durante a reacção e que portanto a actividadeda enzima se mantenha constante.Determinação das velocidades iniciais, v0Para determinar a velocidade inicial (v0) da reacção de hidrólise é necessário adicio-nar a uma solução de sacarose uma certa quantidade da enzima invertase, em concentra-ções tais que não não saturem a enzima. Desta solução são então retiradas alíquotas aostempos 0, 1, 2, 3, 4 e 5 minutos às quais é adicionada solução de DNS. Esta solução pára areacção, por inactivação da enzima, e permite dosear os produtos formados para cada umdesses tempos. O declive da regressão linear aplicada aos dados ([glucose], tempo) é a veloci-dade média da reacção nos seus primeiros 5 minutos, velocidade essa que se consideraconstante e uma boa aproximação da velocidade inicial (Figura 3). Para mostrar que assim éconsidera-se a expressão da cinética de Michaelis-Menten que descreve a variação da con-centração de produto com o tempo, isto é, o integral da Equação 1:t vmax  =  [P] + KM ln(1+ [P]/([S]0–[P])) (7)onde [S]0 é a concentração de substrato (sacarose) no tempo zero e [P] é a concentração deproduto (glucose, por exemplo) no tempo t. A Figura 3 mostra como a variação de [P] não élinear com o tempo. No entanto, no início da reacção, verifica-se que [S] >> [P] o que, dado queln(1+x) ≈ x, se x << 1, permite eliminar o logaritmo da equação 7 para obter uma forma válidapara os primeiros instantes da reacção:t vmax  ≈  [P] + KM [P]/([S]0–[P]) (8)Reorganizando os termos em ordem a [P], esta equação pode ser expressa na forma[P]  ≈  t vmax [S]0 / (KM + [S]0) (9)Figura 3 - Evolução com o tempo das concentrações durante uma reacção enzimática com cinética de Michaelis-Menten.6o que mostra haver, no início da reacção, uma relação linear entre [P] e o tempo, dependendoapenas da constante vmax [S]0 / (KM + [S]0). Não é coincidência que esta constante tenha aforma da Equação 1 pois diferenciando a Equação 9 obtém-se∆[P]  ≈  ∆t vmax [S]0 / (KM + [S]0)    <=>∆[P]/∆t  ≈  vmax [S]0 / (KM + [S]0)  =  v0 (10)A equação 10 mostra que a velocidade instantânea inicial (em rigor quando t = 0) éaproximadamente constante durante o intervalo ∆t se [P] << [S], ou seja, a velocidade médiadurante os primeiros instantes de uma reacção que se inicia só com sacarose e enzima éuma boa aproximação da velocidade inicial e será tanto melhor quanto menor puder ser ∆t.Determinação de KM e k2 da invertaseDe posse de valores para v0 em função de [S]0 é possível por regressão não linear daequação 1, ou regressão linear da equação 4, obter os parâmetros da enzima KM e vmax. Aregressão não linear é de preferir por proporcionar uma estimativa directa das incertezasassociadas aos parâmetros.Sabendo vmax e a concentração de enzima usada é possível calcular a constante k2através da equação 3.Variação de k2 com a temperaturaOs dados de k2 em função da temperatura permitem estimar os valores de entalpia e deentropia de activação aparentes do passo [ES] -> E + P por regressão não linear da equação deEyring, correspondente à teoria do estado de transição:k2  =  (kBT/h) exp(–∆G‡/(RT))  =  (kBT/h) exp(–∆H‡/(RT)) exp(∆S‡/R) (11)ou por regressão linear da sua forma logarítmicaln(k2/T)  =  (–∆H‡/(RT)) + (∆S‡/R) + ln(kB/h) (12)onde kB é a constante de Boltzman, h é a constante de Planck, T é a temperatura em Kelvin,R é a constante dos gases ideais e ∆H‡, ∆S‡ e ∆G‡ são, respectivamente, variação de entalpia,variação de entropia e variação de energia de Gibbs padrão de activação. Tal como referidona sub-secção anterior, também neste caso a regressão não linear é de preferir por proporci-onar uma estimativa directa das incertezas associadas aos parâmetros.Protocolo laboratorialMaterialTubos de ensaioPipetas automáticasVortexBanho-maria7CronómetroPipeta de 10 cm3EspectrofotómetroAgitadores magnéticosPlaca de aquecimentoGobelésGeloSuportes para tubos de ensaioReagentesSolução de NaH2PO4 0,1 MSolução de invertase(Sigma-Aldrich I4504, MM = 270 x 103 g/mol, 1,00 g dm–3 em NaH2PO4 0,1 M)Reagente de DNS (contendo ácido dinitrosalicílico a 10 g dm–3, isto é, 0,044 mol dm–3)Água desionizadaSoluções de sacarose 0,010, 0,025, 0,050 e 0,080 M em NaH2PO4 0,1 MTécnica1. Identificar cada um dos gobelés de 50 cm3 das soluções de sacarose com as letras A,B, C e D. Manter os gobelés num banho de água a temperatura constante. Informe-sejunto do docente sobre a temperatura a estabilizar (usar gelo e água quente conformenecessário).2. Para cada solução de sacarose, utilizar seis tubos de ensaio que deve codificar de 0xa 5x, em que x é a letra de código dessa solução de sacarose, A, B, C ou D.3. Pipetar, com pipeta automática, 1 cm3 do reagente DNS para todos os tubos de ensaioreferidos em 2.4 - Retirar, com pipeta automática, 1 cm3 de cada uma das soluções de sacarose paracada um dos tubos zero (“brancos”).5 - Pipetar, com pipeta automática, 1 cm3 da solução da enzima e adicioná-la ao gobeléque contém a solução de sacarose 0,010 M, desencadeando simultaneamente o cronó-metro e agitando com uma vareta de vidro durante alguns segundos para homogeneizara mistura.6 - Uns segundos antes do minuto 1, recolher, com pipeta automática, uma amostra de1 cm3 da solução contida no gobelé. Exactamente ao minuto 1 despejar a amostra direc-tamente para o fundo do tubo de ensaio 1 referente a esta concentração de sacarose.Agitar o tubo de ensaio no vortex e voltar a colocá-lo no suporte.7 - Repetir a operação descrita em 6 para os minutos 2, 3, 4 e 5.8 - Terminados estes ensaios, colocar os tubos de ensaio em banho-maria ferventedurante exactamente 8 minutos. É importante que a água esteja em ebulição quandoos tubos forem colocados no banho.

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Introdução à cinética enzimática. Cinética da catálise pela invertase.

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