New generation sequencing: the parasite paradigm

Abstract

Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular obrigatório responsável pela Toxoplasmose, infetando diferentes espécies incluindo o Homem. Na Europa e no Norte da América, T. gondii tem uma população clonal constituída por tipo I, II, III. No entanto, estudos recentes têm descrito uma maior diversidade genética, com a identificação de estirpes recombinantes e atípicas mais virulentas. Em Portugal, o conhecimento dos genótipos circulantes de T. gondii é limitado. Neste sentido, estudou-se a diversidade genética de 68 estirpes, incluindo 51 estirpes de T. gondii isoladas em Portugal, a estirpe de referência RH e 16 outras estirpes de referência. Neste estudo realizou-se a genotipagem clássica (Sag2), PCR multiplex de 5 microssatélites e uma combinação de sequenciações por Sanger e NGS de oito loci responsáveis pela virulência. A genotipagem clássica (tipo I, II, III) foi obtida em 100% das estirpes e mostrou que a maioria das estirpes isoladas em Portugal eram do tipo II (70,6%; 36/51) e as restantes 15 do tipo I. A análise de microssatélites por PCR multiplex aumentou o poder discriminatório em apenas mais um tipo identificado. Contudo, quando se adicionaram as metodologias de sequenciação por Sanger e NGS o poder discriminatório aumentou para 36 tipos diferentes. A combinação destas metodologias (Sanger/NGS) permitiram a identificação de uma estrutura mosaico nos isolados de T. gondii em Portugal, não conseguida anteriormente por qualquer uma das outras tecnologias utilizadas.Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite, which is responsible for toxoplasmosis in dif ferent species, including humans. T. gondii have a distinct clonal population structure composed of type I, II and III lineages in Nor th America and Europe. However, recent studies demonstrated a higher diversity given by recombinant and atypic strains, which are believed to be more virulent. The scenario of the distribution of T. gondii genotypes is lacking in Por tugal. In order to achieve this knowledge we studied the genetic diversity of 68 T. gondii strains, included 51 isolated in Por tugal, a reference strain RH and 16 others reference strains). We per formed classical genotyping (Sag2), 5 microsatellites multiplex PCR and a combination of Sanger sequencing and Nex t Generation Sequencing (NGS) of eight loci likely responsible for virulence. The classical genotyping was achieved in 100% of strains. The majority of strains (70.6%; 36/51) isolated in Por tugal were type II whereas the others 15 were type I. However, when Sanger and NGS sequencing methodologies were added, discriminator y power increased to 36 dif ferent types. The combination of these methodologies (Sanger/NGS) allowed the identification of a mosaicism in the isolates of T. gondii in Por tugal, previously not achieved by any of the other technologies used.Este trabalho foi financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/75154/2010).info:eu-repo/semantics/publishedVersio