O risco que as florescências cianobacterianas representam para a
saúde humana advêm do facto destes desenvolvimentos excessivos
estarem frequentemente associados à produção de cianotoxinas. As principais vias de exposição para o homem
são através de água potável contaminada, diálise, consumo de
peixe e marisco contaminado e atividades recreativas. A toxicidade
destes compostos é elevada, como pode ser constatado no gráfico
1 em que está representada a comparação da toxicidade, com
base na dose-letal (LD50%) em murganhos, entre as cianotoxinas e
algumas das toxinas mais conhecidas em relação ao cianeto

Churro, Catarina

Valério, Elisabete

Repositório Científico do Instituto Nacional de Saúde

19_IntroduçãoO que são cianobactérias?Cianobactérias são organismos procariotas fotossintéticos, e como constituintes naturais do fitoplâncton são uma componente essen-cial na produção primária e cadeia alimentar em ambientes de água superficiais. Contudo são também responsáveis pela eutrofização dos recursos hídricos, uma vez que algumas espécies podem desen-volver-se rapidamente e formar grandes acumulações chamadas de florescências ou blooms (figura 1). Este desenvolvimento anómalo afeta adversamente a qualidade das águas superficiais que são usa-das para captação de água para consumo humano, atividades recre-ativas e agricultura (1).Porquê a monitorização de cianobactérias?O risco que as florescências cianobacterianas representam para a saúde humana advêm do facto destes desenvolvimentos excessi-vos estarem frequentemente associados à produção de cianotoxi-nas (quadro 1) (1). As principais vias de exposição para o homem são através de água potável contaminada, diálise, consumo depeixe e marisco contaminado e atividades recreativas (2). A toxicida-de destes compostos é elevada, como pode ser constatado no grá-fico 1 em que está representada a comparação da toxicidade, com base na dose-letal (LD50%) em murganhos, entre as cianotoxinas e algumas das toxinas mais conhecidas em relação ao cianeto (3). _MétodosIdentificação e quantificação tradicional de cianobactérias As cianobactérias são identificadas por taxonomia clássica usando microscopia ótica, com base em características morfológicas que são utilizadas para classificar as várias espécies. A quantificação celular é determinada pela contagem de células individuais em câ-maras de sedimentação com volume conhecido usando o método de Utermöhl (4). Este processo é dependente do operador, sendo necessário uma pessoa com experiência e conhecimentos apro-_Abordagem multidisciplinar na identificação e monitorização de cianobactérias potencialmente tóxicas  Catarina Churro, Elisabete Valério  catarina.churro@insa.min-saude.pt Unidade de Água e Solo. Departamento de Saúde Ambiental, INSA.artigos breves_   n. 6 _Saúde AmbientalFigura 1:      Florescência das cianobactérias Microcystis aeruginosa e Planktothrix agardhii em uma albufeira portuguesa usada para fins recreativos. Adaptado de Codd 2014) (3) e Merel et al. 2013 (5).  Quadro 1:      Cianotoxinas produzidas por cianobactérias comuns nas albufeiras portuguesas.CianotoxinaHepatotoxinasNeurotoxinasAtividadeMicrocistinasCilindrospermopsinaInibição das fosfatases proteicasInibição da síntese proteicaMicrocystis,Anabaena,Nostoc,Planktothrix,Anabaenopsis, PhormidiumCylindrospermopsis, Aphanizomenon, Anabaena, RaphidiopsisAnatoxina-aAnatoxina-a(s)SaxitoxinaLiga-se aos recetores de acetilcolina nicotínicosInibe a acetilcolinesteraseLiga-se aos canais de sódioAphanizomenon, Anabaena, Raphidiopsis, Osci l lator ia, Planktothrix,Cyl indrospermumAphanizomenon, AnabaenaAphanizomenon, Anabaena, Planktothrix, Cyl indrospermopsis, LyngbyaCianobactériaInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.pt2ª sérienúmero1120artigos breves_  n. 6fundados de taxonomia para conseguir uma correta identificação. Contudo, para algumas cianobactérias a distinção entre espécies é uma tarefa difícil mesmo para um taxonomista experiente assim como é difícil de distinguir o limite entre células, o que pode inter-ferir com a sua estimativa. Deteção e quantificação de cianotoxinasA deteção e quantificação de muitas cianotoxinas (microcistinas, cilindrospermopsina, anatoxina e saxitoxina) podem ser feitas atra-vés de imunoensaios-ELISA ou ensaios de ligação ao recetor-RBA. Estes ensaios detetam e quantificam através do reconhecimento e ligação a anticorpos ou recetores específicos. Estes métodos são rápidos e sensíveis contudo pode haver reações inespecíficas le-vando a uma sobrestimação da quantidade de toxina presente (5). A cromatografia líquida de alta eficiência-HPLC permite o estudo Botul inaTóxina Tetânica _ Bactér iasBatracotoxina _ SapoTetrodoxina _ PeixeCobratox ina _ CobrasSaxitoxinaNodularinaMicrosistinaAnatoxina _ Cianobactér iasEstr icnina _ PlantasAmatoxinaMuscarinaFalotoxina _ CogumelosCianeto3x10 7x1x10 7x3700x1250x500x1100x230x200x50x20x17x9x6xGráfico 1:      Comparação da toxicidade relativamente ao cianeto, com base na dose letal (LD50%) em murganhos, entre as cianotoxinas e algumas das toxinas mais conhecidas.  aprofundado das toxinas e suas variantes. No entanto requer um extenso processamento da amostra e padrões específicos para cada toxina (3,5).Classificação e identificação molecular de cianobactériasA obtenção de sequências de ADN de genes envolvidos em di-ferentes processos celulares, como é o caso dos genes house-keeping rRNA 16S, rpoC1 e cpcB providenciam a classif icação e identif icação molecular das espécies cianobacterianas. A simila-ridade das sequências destes genes com outras sequências pre-sentes nas bases de dados dá uma indicação da identidade do organismo. A análise filogenética estabelece relações de proximi-dade e ancestralidade com base na similaridade das sequências de ADN. Recorrendo a uma análise filogenética multi locus destes marcadores, aumenta a resolução da identif icação dos isolados de cianobactérias até à espécie. Contudo a classif icação mole-cular requer monoculturas ou culturas puras de cianobactérias.Deteção de genes associados à produção de toxinas As cianotoxinas só são produzidas pelas estirpes que contêm os genes apropriados para o fazer. Já foram descobertos e sequen-ciados quase todos os clusters de genes que conferem às ciano-bactérias a capacidade de proceder à síntese da maior parte das cianotoxinas. A sequenciação completa destes clusters permitiu o desenvolvimento de sondas moleculares gerais para estirpes tóxi-cas das diversas toxinas e específicas para algumas espécies pro-dutoras (6). A amplificação destes marcadores indica o potencial de produção de determinada toxina em amostras ambientais.       Quantificação por PCR em tempo-realA quantificação do número de cópias de um determinado gene em amostras naturais é possível recorrendo à técnica de PCR em tem-po-real. Várias sondas foram já desenvolvidas para a quantifica-ção da população total de uma determinada cianobactéria usando o gene rRNA 16S, cpcB e rpoC1 (6,7). Estão também disponíveis várias sondas para os genes envolvidos na produção das várias to-xinas o que permite quantificar diversos genótipos e a sua propor-ção numa determinada amostra. Adaptado de Metcalf e Codd  2014 (3).Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.pt2ª sérienúmero11Quantiﬁcaçãode genótipos Expressão génica Culturas monoclonais CianotoxinasDeteção e quantiﬁcaçãoDeteção de genótipos ELISA, RBA e HPLCIdentiﬁcação molecular   Florescências cianobacterianasAmostras de campo PCR convencionalPCR em Tempo-real- Composição em toxinas e suas variantes.- Monitorização de toxinas- Composição, diversidade e abundância de espécies - Monitorização de organismos- Distinção entre espécies - Relações f i logenéticas- Acesso a organismos, toxinas e material genético- Avaliação dos fatores que influenciam a produção  de toxina- Rastreio de genótipos- Monitorização de genótipos- Composição e  abundância de genótipos- Monitorização de genótipos- Monitorização de  espéciesIdentiﬁcação morfológicae q uantiﬁcaçãoartigos breves_  n. 621Os resultados apresentados são o valor médio (±EP) de 3 experiências independentes (para A, C e D), e o valor médio (±DP) (para B). A concentração de 0 mg SEQ/mL corresponde ao controlo de solvente (DMSO a 2%, com exceção da amostra N1 no ensaio do cometa que corresponde a 0,5%). CBMN– Célula binucleada micronucleada;  - Diferenças estatisticamente signif icativas quando comparado com o respetivo controlo. No gráfico 1C e 1D, para as amostras N1 e N2, as concentrações mais elevadas não foram testadas devido à elevada citotoxicidade observada nestas condições.Expressão génicaA taxa de produção das cianotoxinas é também influenciada por fatores ambientais, tais como pH, nutrientes, temperatura e in-tensidade luminosa (8-10). Têm-se realizado vários estudos no sentido de compreender de que forma estes fatores ambientais afetam/alteram a expressão dos genes das cianobactérias, prin-cipalmente os genes dos clusters responsáveis pela produção de cianotoxinas.Manutenção de culturas de cianobactériasO isolamento e manutenção de culturas monoclonais de cianobac-térias provenientes de florescências dão um apoio fundamental ao estudo e monitorização destes organismos. A existência dessas culturas permite avaliar a sua toxicidade, traçar o perfil de toxinas que produzem, obter o ADN para testar e desenvolver sondas mo-leculares e efetuar o estudo aprofundado da sua identificação.  _ConclusõesDesafios na monitorização de cianobactérias e multidisciplinaridadeAs florescências cianobacterianas são fenómenos complexos e os fatores que regulam o seu aparecimento, desenvolvimento e persistência nos sistemas aquáticos ainda não são com-pletamente conhecidos. Compostas frequentemente por diferentes espécies produtoras e não produtoras de toxinas, acresce que dentro da mesma espé-cie existem estirpes tóxicas e não tóxicas. Além do mais, a regulação genética e fatores que in-fluenciam a produção de cianotoxinas são ain-da um desafio para os investigadores. Várias toxinas podem estar presentes e podem ter ori-gem no mesmo ou em diferentes organismos. Neste contexto, é importante compreender que organismos estão presentes, averiguar se têm o potencial para produzir toxinas, que toxinas podem produzir e se estão ativamente em produção. Todos os métodos anteriormente descritos dão uma in-formação diferente e pertinente para o estudo da composi-ção das florescências cianobacterianas (figura 2). A identificação e enumeração ao microscópio podem ser demo-radas e trabalhosas mas fornece informação detalhada sobre a composição de espécies. A deteção imunológica de toxinas é um método rápido e sensível para a quantificação de toxinas na água potável antes e depois do tratamento. O imunoensaio em conjunto com a identificação e quantificação microscópica dá informação útil sobre a composição e abundância da comunidade e quantida-de de toxina para as análises de rotina de amostras ambientais. A deteção molecular de genes responsáveis pela produção de cia-notoxinas informa se os organismos presentes na amostra têm ou não o potencial para a sua produção, o que se torna muito útil como ferramenta de rastreio para as várias toxinas que possam estar pre-sentes e direcionando qual o imunoensaio que deverá ser aplicado para a deteção de uma toxina específica.Figura 2:      Multidisciplinaridade na identificação e monitorização de cianobactérias potencialmente tóxicas.Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.pt2ª sérienúmero1122Os resultados apresentados são o valor médio (±EP) de 3 experiências independentes (para A, C e D), e o valor médio (±DP) (para B). A concentração de 0 mg SEQ/mL corresponde ao controlo de solvente (DMSO a 2%, com exceção da amostra N1 no ensaio do cometa que corresponde a 0,5%). CBMN– Célula binucleada micronucleada;  - Diferenças estatisticamente signif icativas quando comparado com o respetivo controlo. No gráfico 1C e 1D, para as amostras N1 e N2, as concentrações mais elevadas não foram testadas devido à elevada citotoxicidade observada nestas condições.Referências bibliográficas:(1) Chorus I, Bar tram J (eds). Toxic cyanobacteria in water: a guide to their public health consequences, monitoring and management. London; New York: E&FN Spon, behalf of UNESCO, WHO, UNEP, 1999.(2) Codd G, Bell S, Kaya K, et al. Cyanobacterial toxins, exposure routes and human health. Eur. J. Phycol. 1999;34(4):405-15. (3) Metcalf J, Codd G. Cyanobacterial toxins (cyanotoxins) in water: A review of current knowledge. United Kingdom: Foundation for Water Research, 2014.(4) BS EN 15204:2006 - Water quality. Guidance standard on the enumeration of phytoplankton using inver ted microscopy (Utermöhl technique). London: British Standards Institution, 2006.(5) Merel S, Walker D, Chicana R, et al. State of knowledge and concerns on cyanobacterial blooms and cyanotoxins. Environ Int. 2013;59:303-27. (6) Kurmayer R, Christiansen G. The genetic basis of toxin production in Cyanobacteria. Freshw Rev. 2009; 2:31-50.(7) Churro C, Pereira P, Vasconcelos V, et al. Species-specif ic real-time PCR cell number quantif ication of the bloom-forming cyanobacterium Planktothrix agardhii. Arch Microbiol. 2012;194(9):749-57.(8) Sivonen, K. Ef fects of l ight, temperature, nitrate, or thophosphate, and bacteria on growth of and hepatotoxin production by Oscil latoria agardhii strains. Appl Environ Microbiol. 1990;56(9):2658-66.  (9) Song L, Sano T, Li R, et al. Microcystin production of Microcystis viridis (cyanobacteria) under dif ferent culture conditions. Phycol. Res. 1998;46(Suppl 2): 19-23.(10) Wiedner C, Visser PM, Fastner J, et al. Ef fects of l ight on the Microcystin content of Microcystis strain PCC 7806. Appl Environ Microbiol. 2003;69(3):1475-81.artigos breves_  n. 6O PCR em tempo-real faculta a quantificação precisa de um deter-minado gene, permitindo assim obter informação sobre composi-ção de genótipos tóxicos que aliado ao imunoensaio indica estirpes tóxicas e não tóxicas e se estão em produção ativa de toxina. Esta abordagem é também bastante útil na quantificação de espécies di-fíceis de identificar e contar por microscopia ótica.Outros métodos que têm limitações para ser aplicados em rotina podem fornecer informações importantes para complementar e fa-cilitar a monitorização. A análise aprofundada do perfil toxicológico dos isolados por HPLC, ou a identificação das espécies por análi-se filogenética permite saber que toxinas e que espécies podemos observar nas amostras de campo. O estudo da regulação genética da produção de cianotoxinas por PCR em tempo-real permite com-preender em que condições os organismos produzem toxina, e que fatores influenciam a sua produção.De forma a dar respostas na prevenção da exposição a cianotoxi-nas em saúde pública, o estudo e monitorização de cianobacté-rias e cianotoxinas deve recorrer às várias metodologias de uma forma multidisciplinar, em que cada uma delas se complementa e contribui com uma pequena peça do grande puzzle que são as florescências cianobacterianas. Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.pt2ª sérienúmero11LINKLINKLINKLINKLINK

Abordagem multidisciplinar na identificação e monitorização de cianobactérias potencialmente tóxicas

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