Transcription regulation across levels of chromatin organization

Abstract

With advancements in high-throughput sequencing and high-resolution microscopy techniques, the significance of genome organization in transcription regulation is rapidly unveiling. Nonetheless, we are yet far from completely understanding this key relationship. In this thesis, I utilize some of the cutting-edge high-throughput sequencing techniques along with the power of Drosophila as a model to understand some of the molecular mechanisms active at various levels of chromatin organization that influence gene expression. At the level of DNA sequence, our analysis revealed occupancy of CBP/p300, a transcription co-activator and histone acetyltransferase at insulator regions genome wide, we also identified a novel role of CBP as a barrier to heterochromatin spreading at these insulator regions. To gain insight into transcription regulation at level of nucleosomes, we perturbed histone modifications either chemically, by inhibiting histone deacetylases (HDACs), or genetically, by creating Drosophila mutants for the H3K14 residue.  We found that the immediate transcriptional response to HDAC inhibition is only up-regulation (96 genes). Moreover, our results suggest that histone acetylation stimulates transcription by releasing promoter-proximal paused Pol II into elongation. In another study we discovered that acetylation of histone 3 lysine 14, H3K14ac, decorates some genes that lack canonical histone marks, thereby constituting a unique chromatin state. Further, Drosophila mutants expressing only H3K14R histones revealed that this residue is vital for expression of these genes, for animal survival and for developmental patterning. To further understand gene regulation during tissue specification in early embryo development, we utilized dorsoventral (DV) patterning as a model along with PRO-seq, ATAC-seq and ChIP-seq. We identified zygotically transcribed DV patterning genes that are spatially and temporally resolved. Most interestingly, the DV patterning genes are all highly paused and promoter proximal paused Pol II is released into active elongation in a tissue-specific manner. Finally our single cell RNA-seq (scRNA-seq) and HiC data in DV mutants revealed that differential regulation of gene expression occurs independently of differences in higher-order chromatin organization. Collectively, we provide evidence that transcription is being modulated at various levels of chromatin organization and our results suggest that histone modifications but not higher order chromatin organization influence transcriptional output.Med framsteg inom high-throughput sekvensering och högupplösta mikroskopitekniker uppenbaras betydelsen av genomets organisation för transkriptionsreglering i snabb takt. Ändå är vi ännu långt ifrån att helt och hållet att förstå detta viktiga förhållande. I denna avhandling använder jag några banbrytande high-throughput sekvenseringstekniker tillsammans med Drosophila som en kraftfull modell för att förstå några av de molekylära mekanismer som är aktiva vid olika nivåer av kromatinorganisering och som påverkar genuttryck. På DNA-sekvensnivå visade vår analys att CBP/p300, en transkriptions-coaktivator och histonacetyltransferas, intar insulator områden över hela genomet. Vi identifierade också en ny roll för CBP som en barriär mot heterokromatinspridning vid dessa insulator-regioner. För att få insikt i transkriptionsreglering på nukleosomnivå så rubbade vi histonmodifieringar antingen kemiskt, genom att hämma histondeacetylaser (HDAC), eller genetiskt genom att skapa Drosophila mutanter för H3K14. Vi fann att det omedelbara transkriptionella svaret på HDAC-hämning endast omfattar uppreglering (96 gener). Dessutom tyder våra resultat på att histonacetylering stimulerar transkription genom att frisätta promotor-proximal pausad Pol II till elongering. I en annan studie upptäckte vi att acetylering av histon 3 lysin 14, H3K14ac, dekorerar vissa gener som saknar typiska histonmodifieringar och därmed utgör ett unikt kromatintillstånd. Vidare avslöjade Drosophila mutanter som endast uttryckte H3K14R histoner att denna aminosyra är avgörande för uttryck av dessa gener, för djurets överlevnad och för mönsterbildande under djurets utveckling. För att ytterligare förstå genreglering under specificering av olika vävnader i tidig embryoutveckling använde vi dorsoventral (DV) mönsterbildning som modell tillsammans med PRO-seq, ATAC-seq och ChIP-seq. Vi identifierade zygotiskt transkriberade DV-mönstergener som kunde separeras rumsligt och över tid. Det mest intressanta är att DV-mönstergenerna är högt pausade och att promotor-proximal pausad Pol II frigörs till aktiv elongering på ett vävnadsspecifikt sätt. Slutligen uppenbarade vår enkelcells RNA-seq (scRNA-seq) och HiC-data i DV-mutanter att differentiell reglering av genuttryck sker oberoende av skillnader i högre nivåer av kromatinorganisation. Sammantaget tillhandahåller vi bevis på att transkription moduleras vid olika nivåer av kromatinorganisation och våra resultat tyder på att histonmodifieringar, men inte högre nivåer av kromatinorganisation, påverkar gentranskription