Studies on the biosynthesis and heterologous expression of complex secondary metabolites from streptomycetes

Abstract

The heterologous expression of natural product biosynthetic pathways is of increasing interest in biotechnology and drug discovery. This approach enables the production of complex metabolites in more amenable host organisms and provides the basis for the generation of novel analogs through genetic engineering. In this thesis, we describe a straightforward strategy for the heterologous expression of the highly complex phenalinolactone biosynthetic pathway, which was recently cloned from Streptomyces sp. Tü6071. Using Red/ET recombineering, the phenalinolactone pathway was reconstituted from two cosmids and heterologously expressed in several Streptomyces strains. The established expression system now provides a convenient platform for functional investigations of the biosynthetic genes and the generation of novel analogs, by genetic engineering of the pathway in Escherichia coli. The second part of this thesis describes work on a distinct class of secondary metabolites, the GE81112 tetrapeptide family. We developed a strategy for the cloning and identification of the GE81112 biosynthetic gene cluster, in order to investigate the biosynthetic pathway in detail. Generation of a cosmid library enabled us to identify the corresponding biosynthetic gene cluster on two overlapping cosmids. In parallel, we established methods to manipulate the strain genetically, allowing us to verify the identity of the GE81112 gene cluster by gene inactivation experiments. In addition, we characterized several proteins from the pathway using enzymatic assays in vitro. Taken together, these data have enabled us to propose a preliminary model for GE81112 biosynthesis. The results also open the door to developing new derivatives of these promising compounds by genetic engineering.Die heterologe Expression komplexer Naturstoff-Biosynthesewege spielt eine immer größer werdende Rolle bei der Entdeckung und Modifikation von Wirkstoffen aus der Natur und gewinnt somit zunehmend an Bedeutung in der biotechnologischen Forschung. Diese Methode ermöglicht die Produktion komplexer Metabolite in leicht handhabbaren Wirtsorganismen und bildet so die Grundlage für die Entwicklung neuer Naturstoffderivate durch genetische Manipulation der Biosynthesewege. Die vorliegende Arbeit beschreibt eine innovative Strategie für die heterologe Expression des komplexen Phenalinolacton- Biosynthesewegs aus dem Streptomyceten Tü6071. Mit Hilfe der Red/ET Rekombination wurde dieses Gencluster, das auf 2 Cosmiden vorlag, kloniert und in verschiedenen Streptomyceten-Stämmen heterolog exprimiert. Das somit etablierte Expressionssystem bietet nun die Möglichkeit, durch gezielte genetische Manipulation der Biosynthesewege in Escherichia coli und anschließende heterologe Expression neue, möglicherweise wirksamere Naturstoffe und Naturstoffderivate zu entwickeln. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit Untersuchungen zur Biosynthese einer ungewöhnlichen Klasse von Sekundärstoffen: den GE81112 Tetrapeptiden. Um die zugrundeliegende Biosynthese dieser Naturstoffe nun detailliert zu untersuchen, wurde eine Strategie für die Klonierung und Identifizierung des entsprechenden Genclusters entwickelt, das schließlich auf zwei überlappenden Cosmiden identifiziert wurde. Gleichzeitig konnten Methoden zur genetischen Manipulation des Stammes entwickelt werden, die es ermöglichten das Gencluster durch Geninaktivierungsexperimente zu identifizieren. Mit Hilfe der erhaltenen Ergebnisse konnte schließlich ein erstes Model für die GE81112 Biosynthese erarbeitet werden. Die in dieser Arbeit erhaltenen Einblicke in die Biosynthese können in Zukunft einen wichtigen Beitrag zur Entwicklung neuer GE81112 Derivate leisten