Analysis of TRPM3 cation channels using knock down and knock out methods

Abstract

Einen wesentlichen Anteil an der Regulation der intrazellulären Ca2+-Konzentration haben Kationenkanäle aus der Familie der TRP-Proteine. Vermutlich 4 TRP-Proteine bilden homo- und heterooligomere Kanalkomplexe. TRPM3 ist das zuletzt identifizierte Mitglied der TRPM-Subfamilie mit größter Homologie zu TRPM1. Das TRPM3-Gen codiert eine Vielzahl von Spleissvarianten, welche Unterschiede hinsichtlich ihrer Permeabilität für divalente Kationen und ihrer Aktivierbarkeit durch das Steroid Pregnenolonsulfat aufweisen. Ich habe gezeigt, dass TRPM3 vor allem im Plexus choroideus, in ß-Zellen und in der Hypophyse exprimiert wird. Aus Ins-1- und GH3-Zellen sowie aus dem Hirn der Ratte habe ich neben bekannten TRPM3-Varianten 9 bislang unbekannte kloniert. FURA-2 Messungen zeigten, dass Pregnenolonsulfat in Ins-1- und GH3-Zellen einen Ca2+-Einstrom auslöst. Eine Hemmung von TRPM3 mit Hilfe von RNA-Interferenz ebenso wie eine Überexpression von TRPM1 und TRPM31 führte in diesen Zellen zu einer deutlichen Abnahme des Steroid-induzierten Ca2+-Einstroms, was stark darauf hindeutet, dass TRPM3-Kanäle für den Ca2+-Einstrom verantwortlich sind. Um die biologische Funktion von TRPM3 zu untersuchen, habe ich eine TRPM3-defiziente Mauslinie hergestellt. Dabei wurde Exon 24 deletiert, da es die ionenleitende Pore des Kanals codiert. Die angewandte Strategie erlaubt zudem eine zeit- oder gewebespezifische Inaktivierung des TRPM3-Gens sowie die Identifizierung TRPM3-exprimierender Zellen anhand ihrer grünen Fluoreszenz.Cation channels of the TRP family play a substantial role in the regulation of the cytosolic Ca2+ homeostasis. Presumably, TRP channel subunits assemble into homo- or heterotetrameric channel complexes. TRPM3 is the most recent identified member of the TRPM subfamily and shows highest homology to TRPM1. The TRPM3 gene encodes a variaty of splice variants. These variants differ in their permeability for divalent cations and their activation by the steroid pregnenolonesulfate. In this work I showed that TRPM3 is strongly expressed in the choroid plexus, in pancreatic ß-cells and in the pituitary gland. I cloned several variants of TRPM3 from Ins-1 cells, GH3 cells and rat brain. Nine new splice variants were identified. Pregnenolonesulfate induces Ca2+ entry in GH3 and Ins-1 cells as measured with the calciumindicatordye FURA-2. Inhibition of TRPM3 using a RNA interference approach and overexpression of TRPM1 and TRPM31 led to a significant reduction of the steroid induced Ca2+ influx in these cells. These data strongly suggest that TRPM3 channels are responsible for the steroid induced Ca2+ entry in endocrine cells. To analyze the biological functions of TRPM3 channels, I generated a TRPM3 deficient mouse line. Thereby exon 24 was deleted since it encodes the ion conducting pore of the channel. Furthermore, the applied strategy allows a time- or tissue-specific inactivation of the TRPM3 gene and in addition the identification of TRPM3 expressing cells by their green fluorescenc