Alarcón de la Lastra Romero, Catalina

Camacho Barquero, Laura

Motilva Sánchez, Virginia

Sánchez Calvo, Juan Manuel

Sánchez Fidalgo, Susana

Talero Barrientos, Elena Mª

idUS. Depósito de Investigación Universidad de Sevilla

Talero, E., Sánchez-Fidalgo, S., Alarcón de la Lastra, C., Camacho-Barquero, L., Sánchez-Calvo, J.,  Motilva, V.Departamento de Farmaco-logía, Facultad de Farmacia, Universidad de SevillaINTRodUCCIÓNLa adrenomedulina (AM) es un péptido de 52 aminoácidos aislado en 1993 a partir de extrac-tos de un feocromocitoma humano 1. El gen de la AM se expresa en numerosos órganos y te-jidos incluyendo la glándula suprarrenal, co-razón, pulmón, tractos digestivo y genitouri-nario o el sistema nervioso central. Es un pép-tido regulador que juega un papel fundamen-tal en numerosas funciones biológicas, entre las que destacan su función vasodilatadora y broncodilatadora, la inhibición de la secreción de numerosas hormonas, su actividad antimi-crobiana, la regulación de la función renal o de la proliferación celular, entre otras 2.Existen interesantes evidencias que sugie-ren que la AM podría actuar como un factor inmunomodulador endógeno, con efectos fun-damentalmente antiinflamatorios. Su expre-sión varía entre diferentes células y órganos del sistema inmune; en este sentido, se mues-tra  incrementada en el timo y disminuida en el bazo. Las células leucocitarias, incluyendo monocitos, macrófagos o neutrófilos también producen cantidades importantes del péptido, especialmente tras estímulos inflamatorios3,4,5 y se ha observado que su expresión incremen-tada en condiciones inflamatorias se produce tanto en circunstancias experimentales como clínicas, incluyendo el proceso de sepsis pro-ducida por endotoxinas4,6. La AM liberada po-dría promover la regulación del flujo sanguí-neo local, modular la actividad de diferentes enzimas, como la óxido nítrico sintetasa, o fa-vorecer la producción de quimiocinas y cito-cinas7.También se ha observado que el pépti-do es capaz de modificar la activación de la cascada del complemento a través de su inte-racción con el factor H, proteína de unión a la AM, alterándose la capacidad catalítica de di-cho factor 8,9.Aún más, en la etapa inicial de la respuesta inflamatoria se ha demostrado una estrecha relación entre ciertas citocinas proin-flamatorias, como factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) o interleucina 1-beta (IL-1β), con la AM; estudios previos sugieren que el pép-tido actuaría como parte de un mecanismo de retroalimentación previniendo la sobrepro-ducción de estas citocinas 10.Por otro lado, el término de Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) se utiliza desde hace años para designar a las enfermedades inflamatorias del intestino, principalmente del intestino grueso, de etiología no bien co-nocida y siempre de evolución crónica. Com-prende a la Colitis Ulcerosa y a la Enferme-dad de Crohn. Ambas comparten aspectos epidemiológicos y síntomas clínicos, signos radiológicos y hallazgos anatomopatológi-cos comunes y se han valorado diferentes factores que contribuyen a la patogénesis de esta enfermedad; destacamos los ambien-tales, los genéticos o los inmunes. Existen evidencias de que el inicio de los cambios inflamatorios que ocurren en la mucosa in-testinal es consecuencia de una aberrante respuesta por alteración de la tolerancia del sistema inmume a antígenos endógenos. És-tos son procesados por los macrófagos que lo presentan a las células T CD4+, que al ser activadas, elaboran y secretan varias ci-tocinas como TNF-α, interferón γ (IFN-γ) o IL-12. Todas estas sustancias estimulan la secreción de otros mediadores, que ampli-XXVIII CoNGrESo NACIoNAL DE LA SEF PÓSTEr PrEMIADoEfecto protector del péptido adrenomedulina en  la colitis inflamatoria experimentalTalero, E., Sánchez-Fidalgo, S., Alarcón de la Lastra, C.,  Camacho-Barquero, L., Sánchez-Calvo, J., Motilva, V.ActuAlidAd en FArmAcologíA y terApéuticA  -  -  marzo 2007 |  volumen 5  nº 1  | la sef informafican la respuesta inflamatoria, como pros-taglandinas, leucotrienos, o el factor activa-dor de plaquetas. De este modo se produce la activación de los neutrófilos y de nuevos macrófagos que liberan al medio extracelular proteasas, metaloproteinasas, como la mie-loperoxidasa (MPO), y numerosos radicales libres derivados del oxígeno, contribuyendo todo ello al daño tisular 11.Actualmente las terapias con fármacos anti-inflamatorios e inmunomoduladores ayudan a controlar razonablemente a los pacientes. No obstante, los efectos adversos observados durante el tratamiento junto con las frecuen-tes recidivas obligan en muchos casos, como ultima alternativa, a la resección quirúrgica12.Éstos y otros motivos fuerzan a buscar y eva-luar la eficacia de nuevas terapias capaces de modular a ambos componentes de esta enfer-medad es decir, el inflamatorio y/o el inmu-nológico. Entre los numerosos agentes que se están investigando se encuentran los péptidos gastrointestinales, y entre ellos la AM. Basándonos en los antecedentes anterior-mente citados, en nuestro estudio nos plantea-mos valorar las propiedades de AM siguiendo un modelo experimental de EII por aplicación del hapteno ácido 2,4,6- trinitrobencenosulfóni-co (TNBS) analizando los resultados observa-dos tanto durante la fase aguda de la enferme-dad como en la evolución crónica de la misma así como los cambios bioquímicos y molecula-res asociados.mETodoLoGíAEl estudio ha sido realizado en ratas Wistar de peso medio comprendido entre 150-200 g y mantenidas en condiciones estándares de esta-bulización (24-25 ºC, doce horas de luz al día y alimentación controlada), suministradas por el Centro de Producción y Experimentación Ani-mal de la Universidad de Sevilla. Doce horas antes de comenzar los ensayos, los animales fueron mantenidos en ayunas, permitiendo el libre acceso al agua y en jaulas individuales. To-dos los protocolos llevados a cabo han seguido las recomendaciones relativas a la experimenta-ción animal (Real Decreto 1201/2005, desarro-llado por la Comunidad Autónoma Andaluza, Decreto 199/2005). El péptido fue suministrado por NeoMPS (Group SNPE, Estrasburgo, Francia) y hemos seguido dos pautas diferentes en la inducción de la colitis por el hapteno TNBS.  -Modelo agudo (MA), de cuatro días totales de duración de tratamiento con el péptido. -Modelo crónico, de dos y tres semanas de duración (MC1 y MC2, respectivamente).La inflamación en el colon fue inducida si-guiendo la técnica propuesta por Morris y col.13.A los animales anestesiados se les administró, mediante sonda rectal, una dosis única de 10 ó 30 mg de TNBS (Sigma-Aldrich química, S.A., España) para inducir la colitis aguda o cróni-ca respectivamente, y disuelto en 0.25 mL de etanol (50% v/v), manteniendo los animales en posición supina durante unos minutos. En el MA, la AM fue suspendida en solución sali-na (0.9%) y administrada i.p. (0.1 mL/100g ani-mal),  a  dosis de 50, 100 y 200 ng/Kg animal/día, 48, 24 y 1 h antes de la aplicación del TNBS y 24 h después. Los animales fueron sacrifica-dos 24 h tras la última administración.  En el MC, administramos similares dosis de AM, comenzando 24 h después de la inducción de la colitis, y continuando con una administra-ción diaria  durante 2 y 3 semanas.  En todos los ensayos se incluyó un grupo sano (sham) y un grupo control que recibió TNBS. Los días posteriores a la administración del hapteno, se cuantificó el consumo de comida y bebida/ani-mal, se valoró la aparición de diarrea, y se ob-servaron las variaciones de peso.  Tras el sacrificio, el colon fue abierto longitu-dinalmente para observar las lesiones macros-cópicas originadas cuantificándose su exten-sión, superficie lesionada en cm2, y gravedad, según escala propuesta por Bobin-Dubigeon y col.14 con ligeras modificaciones. Una vez valo-rado el daño, el colon fue dividido en 5 piezas con objeto de obtener muestras de tejido viables para las determinaciones bioquímicas posterio-res que se congelaron a -70 °C. El estudio histológico se llevó a cabo según la metodología clásica de inclusión en parafi-na, realizándose una tinción de hematoxilina /eosina. También se analizaron diferentes pa-rámetros bioquímicos con objeto de valorar los cambios en el tejido dañado que el péptido pu-diera inducir. Éstos fueron:•		Determinación de la actividad MPO, corre-lacionable con el grado de infiltración neu-trofílica,  siguiendo un método espectrofo-tométrico15.•		Producción de las citocinas proinflamato-rias TNF-α e IFN-γ y de la citocina anti-inflamatoria IL-10 por técnica de ELISA y -  -  ActuAlidAd en FArmAcologíA y terApéuticA|  volumen 5  nº 1  |  marzo  2007  la sef informautilizando kits comerciales proporcionados por  Diaclone (Francia).•		Expresión en el colon de las proteínas ci-clooxigenasa-2 (COX-2) y óxido nítrico sin-tasa inducible (iNOS) por Western Blot. •		Medida de la liberación de óxido nítri-co cuantificando espectrofotométricamen-te los nitritos totales mediante la reacción de Griess. RESULTAdoS y dISCUSIÓNLa administración intracolónica de 10 mg de TNBS produjo en los animales un cuadro ca-racterístico de colitis aguda (Figura 1A). En los animales correspondientes al grupo control, y sacrificados 48 h después de la aplicación del hapteno, grupo control-TNBS, el estudio ma-croscópico del colon mostraba una mucosa da-ñada, observándose una zona lesionada am-plia, profunda, necrótica y hemorrágica. Des-pués de la administración de AM los datos derivados de la medición directa de la super-ficie dañada, y aquellos obtenidos aplicando la escala propuesta, reflejaron una cierta mejoría que resultaron significativos con la dosis ma-yor del péptido ensayada (200 ng/Kg animal) (Figura 1A).La comparación de los cortes histológicos de tejido intestinal procedente de animales sa-nos con aquellos obtenidos de animales ins-tilados con 10 mg de TNBS (Figura 1B) mos-traba que la estructura histológica normal se transformaba en una lesión que afectaba lon-gitudinal y transversalmente a la glándula in-testinal con una amplia pérdida de su estruc-tura característica siendo esta sustituida por una abundante capa necrótica con presencia de fibroblastos, fibras de colágeno e infiltrado inflamatorio leucocitario, especialmente en zonas de mucosa y submucosa. Sin embargo, los datos microscópicos obtenidos tras el tra-tamiento con AM confirmaron los resultados macroscópicos reflejando una mayor preser-vación de la estructura de la mucosa intesti-nal colónica.Siguiendo el estudio agudo, los datos obte-nidos tras la medida de la actividad MPO no reflejaron diferencias significativas entre los grupos tratados con AM en relación con el grupo control-TNBS (Figura 1A). Respuestas similares fueron observadas tras la cuantifi-cación de las citocinas proinflamatorias. Sin embargo, los resultados correspondientes a la producción de la citocina antiinflamatoria IL-10 pusieron de manifiesto un incremento sig-nificativo de los niveles de esta citocina en los animales tratados con las tres dosis de AM, respecto a los animales control-TNBS, en los que los niveles eran prácticamente indetecta-bles (Figura 1C). La cuantificación de la expre-sión de las proteínas COX-2 e iNOS, por wes-tern-blot reveló, como era de esperar, una in-ducción muy importante en el grupo control-TNBS, incremento que el  péptido sin embar-go no fue capaz de modificar de forma apre-ciable con ninguna de las dosis estudiadas (Figura 1D). Del mismo modo, siguiendo esta pauta aguda de administración de AM, tam-poco se observaron cambios en la producción de nitritos con respecto a los cuantificados en el grupo control-TNBS (Figura 1E).En los estudios crónicos (Figura 2A) la ad-ministración intracolónica de 30 mg de TNBS produjo en los animales, durante las dos y tres semanas posteriores a la inducción de la co-litis, un cuadro importante de colitis crónica manifestada por diarrea sanguinolenta, con pérdida de peso en muchos de los animales implicados en el estudio. Los intestinos, una vez disecados, se presentaban acortados y con evidentes lesiones inflamatorias. La adminis-tración de AM, a las tres dosis utilizadas y en ambos periodos, disminuyó de forma estadís-ticamente significativa la extensión del daño mostrándose un tejido con signos evidentes de mayor recuperación. 02468101214Superficie ulcerada (cm2) *** ++010002000300040005000TNF-α (pg/mg tejido )0100200300Sano TNBS AM 50 AM 100 AM 200Nitritos (uM/mg tejido)COX-2  (72 kDa) iNOS            (130 kDa) β–Actina  (45 kDa) Sano TNBS AM 50 AM 100 AM 2000123Sano TNBS AM 50 AM 100 AM 200MPO (U/mg tejido) *** 0100020003000IFN- γ (pg/mg tejido)*** *** *** **++++02000400060008000Sano TNBS AM 50 AM 100 AM 200IL-10 (pg/mg tejido)***** *** ++++++++A) Superficie ulcerada y actividad MPO C) Producción de citoquinas B) Estudio histológico Control Sano Control TNBS AM 200D) Western- Blot           E) Producción de nitritos**p<0.01 y ***p<0.001 vs. control sano +p<0.05, ++p<0.01 y +++p<0.001 vs. control TNBS Figura 1 |Efectos de la administración de adrenomedulina (AM) en el modelo de colitis. -  -  ActuAlidAd en FArmAcologíA y terApéuticA marzo 2007 |  volumen 5  nº 1  | la sef informaEn los cortes histológicos de tejido intesti-nal de los grupos que recibieron TNBS, a los 14 días y también tras 21 días de su adminis-tración, aparecía una desestructuración tisular, con fusión de la mucosa y submucosa, escaso desarrollo glandular y alto contenido de fibro-blastos, colágeno e infiltrado inflamatorio en la base de la lesión. Sin embargo, la adminis-tración reiterada de adrenomedulina, en am-bos  protocolos, provocó una mejoría evidente, apreciándose glándulas regenerativas infiltrán-dose por el tejido adyacente, más abundantes en las muestras de animales tratados durante 21 días (Figura 2B).Los resultados procedentes del estudio de la actividad MPO mostraron que las tres dosis en-sayadas de péptido disminuían significativa-mente los valores de este parámetro bioquími-co, comparando con el grupo control-TNBS y a las dos pautas aplicadas (Figura 2A). Del mis-mo modo, las medidas de producción de TNF-α e IFN-α indicaron que AM era capaz de reducir intensamente los niveles de ambas citocinas. Por el contrario, los niveles de IL-10 fueron in-crementados por el péptido, especialmente con la dosis mayor ensayada y en el  protocolo de 21 días (Figura 2C). Los niveles de expresión de las proteínas COX-2 e iNOS,  al igual que en el modelo agudo, no fueron modificados por AM (Figura 2D), aunque sí fue detectada una re-ducción significativa en la producción de nitri-tos en los grupos tratados con el péptido tanto a los 14 como a los  21 días de producción de la colitis (Figura 2E).En resumen, además de las funciones ya do-cumentadas relacionadas con el papel de AM tanto en condiciones fisiológicas como patoló-gicas, los resultados de nuestro estudio se su-man a la gran potencialidad de esta molécula como agente antiinflamatorio/inmunomodu-lador ya que dosis muy bajas, del orden de na-nomolar,  favorecen la recuperación del tejido intestinal inflamado desencadenando un ree-quilibrio interesante en la expresión de las cito-cinas implicadas en el proceso patológico.  Kitamura K, Kanga��a K, Ka��amoto M, Ichiki Y, Nakamura S, Matsuo H, Eto T. Adrenomedullin: a novel hypotensive pepti-de isolated from human pheochromocytoma. 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Efecto protector del péptido adrenomedulina en la colitis inflamatoria experimental

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