GLADTKE, E.

Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM)

German

Dokumenten-Publikationsserver der Humboldt-Universität zu Berlin

Gladtke: Bilirubinbestimmung im Serum 63Arylamidase-Gehalt deutlich ansteigt, darf angenommenwerden, daß zumindest ein beträchtlicher Teil dieserZellen den proximalen Tubuli entstammt. Bei Annahmeder physiologischen Mauserung der Tubulusepithelienals Hauptquelle der normalen Arylamidase-Ausscheidungim Urin (4) sollte bei Steigerung der Zellabschilferungum ein mehr als Hundertfaches eine entsprechende Zu-nahme der Aktivität des Überstandes eintreten: Einesolche konnte jedoch nicht festgestellt werden: die Werteblieben innerhalb der Normgrenzen (Abb. 4). Demnachscheint die Urin-Arylamidase zumindest für eine durchAspirin erheblich gesteigerte Abschilferung von Tubu-lusepithelien nicht das erhoffte empfindliche Maß dar-zustellen.Literatur1. NAGEL, E., F. WILLIG und F. H. SCHMIDT, Klin. Wschr. 42, 447(1964). — 2. PATTERSON, E. K., A. KEPPEL und Snu-Hsi HSIAO,J. Histochem. Cytochem. (Baltimore) 9, 608 (1961). — 3. PATTER-SON, E. K., Snu-Hsi-HsiAO und A. KEPPEL, J. biol. 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März 1966)Die Bestimmung des Bilirubins nach FERRO und HAM, die auf einer Oxydation des Bilirubins im sauren Milieu zu einem blauen Farbstoffmit Hilfe von Ferrichlorid beruht, kann wegen unterschiedlicher Adsorption des Farbstoffes an den Eiweißniederschlag sowohl bei ver-schiedenen Serumeiweißkonzentrationen als auch bei verschiedenen Bilirubinkonzentrationen nicht empfohlen werden.The determination of bilirubin according to FERRO and HAM, which depends upon an oxidation of bilirubin with ferric chloride in acidmedium to give a blue colour, cannot be recommended: there is an adsorption of the coloured material onto the protein precipitate, whichvaries both with the concentration of serum protein and with the concentration of bilirubin.In der Pädiatrie besteht vor allem seit Kenntnis derkausalen Zusammenhänge zwischen Bilirubinkonzen-tration und Kernikterus und der Möglichkeit der Ver-hütung des Letzteren ein großes Interesse an derBestimmung des Bilirubins im Serum. Insbesonderejede Möglichkeit zur Vereinfachung der Analyse ist vonNutzen. Wir haben deshalb die von FERRO und HAM (1)empfohlene Methode zur Bestimmung des sog. gesamtenBilirubins kritisch untersucht, da sie den Vorteil hat, miteinem stabilen Misch-Reagenz, also mit zwei Pipettie-rungen (Serum bzw. .Standard- oder Leerwert undReagenz) pro Ansatz auszukommen.MethodikDie Methode beruht darauf, daß Bilirubin bei saurerReaktion in einen blauen Farbstoff übergeht, dessenKonzentration photometrisch bestimmt wird. Die Um-setzung wird durch Ferrichlorid (offenbar katalytisch)beschleunigt.FERRO und HAM säuern mit Trichloressigsäure an, ver-wenden Isopropanol zur Extraktion der Farbe aus demEiweißniederschlag und bringen mit Äthylenglycol-monomethyläther die Lipide in Lösung. Diese dreiReagenzien werden zusammen mit Ferrichlorid zu einemReagenz angesetzt (90 g Trichloressigsäure, Isopropanolauf 900 m/, 100 m/ Äthylenglycol-monpmethylätherund l m/einer 7,2-proz. wäßr. Lösung vonFeC!3· 6H2O),das im Verhältnis 10 zu l (10 Teile Reagenz, l TeilSerum) mit Serum vermischt, nach 5 Min. filtriert undnach 30 Min. bei 660 m/j gemessen wird.Da uns nur eine relativ geringe Menge Originalreagenzzur Verfügung stand, wir außerdem nur kleine Serum-mengen einzusetzen beabsichtigten, adaptierten wir dieMethode zunächst an den Mikrolitermaßstab, in dem wir20 Serum mit 200 Reagenz versetzten; wir bliebendamit beim vorgeschriebenen Mengenverhältnis. DieFiltration wurde durch Zentrifugation ersetzt. FERROund HAM empfehlen in einer zweiten Publikation (2) einähnliches Vorgehen mit allerdings etwas größeren Men-Z. klin. Chem. u. klin. Biochem./5. Jahrg. 1967/Heft 264 Gladtke: Bilirubinbestimmung im Scrumgen (50 und 500 ). Im Mikrolitermaßstab erhielten wirbeim Messen in l cm Schichtdicke in Mikroküvetten diegleichen Extinktionen wie beim Ansatz mit den Mengender Originalvorschrift (l m/ Serum, 10 ml Reagenz).Zur kolorimetrischen Messung ist nur ein Photometermit Glühfadenlampe oder mit Cadmiumlampe geeignet,da im Bereich zwischen 640 und 700 , in dem dieblaue Farbe ihr Adsorptionsmaximum hat, keine ge-nügend starke Quecksilber-Linie existiert. Wir bedientenuns eines Eppendorf-Photometers mit Multiplier undverwendeten die Cadmium-Linie 644 m/i.VersuchsanordnungDa bei dieser Methode mit Eiweißfällung und Ex-traktion gearbeitet wird, war die entscheidende Frage,ob die Extraktion vollständig oder wenigstens pro-portional zum Bilirubingehalt und unabhängig von derMenge des Niederschlags und damit unabhängig vomEiweißgehalt erfolgen würde.Nachdem Eichkurven aus wäßriger und albuminhaltigerBilirubinlösung identisch und linear verliefen, wurde dasVerhalten im Serum untersucht.Zu diesem Zweck wurde eine 80 mg-proz. Bilirubin-lösung in O,!M Natriumcarbonatlösung (80 mg in100 m/) nach SCHELLONG und WENDE (3) hergestellt,daraus durch Verdünnen mit BiLirubin-armem Plasmaentsprechend niedere Konzentrationen gemischt, unddie Bestimmungen durchgeführt. Der Bilirubingehaltder jeweiligen Plasmacharge wurde gesondert bestimmtund abgezogen. Es wurden Ansätze mit etwa 6 g undmit etwa 3 g Eiweiß pro 100 m/ verglichen.Ergebnisse und DiskussionDie in der Tabelle und in der Abbildung aufgeführtenErgebnisse zeigen, daß mit zunehmendem Eiweißgehaltdie Extinktion und damit die gemessene Konzentrationbei gleicher eingesetzter Bilirubinmenge geringer wird.Gleichzeitige Bestimmung aus dem gleichen Ansatz nachJENDRASSIK und CLEGHORN (nach WITH (4)) ergabdagegen bei verschiedenem Eiweißgehalt und gleichervorgelegter Bilirubinmenge die gleiche Extinktion.Außerdem ergibt sich aus den Werten der Abbildung l,daß mit zunehmender Bilirubinkonzentration bei gleicherEiweißkonzentration die Extinktion nicht linear zu-nimmt. In wäßriger Lösung dagegen nimmt die Ex-tinktion linear zu, ebenso in albuminhaltiger Lösung.Die Kurve folgt damit im Serum bzw. in Eiweißlösungnicht dem Lambert-Beer'schtn Gesetz, sondern ist nachunten abgebogen. Das heißt aber, daß bei zunehmenderBilirubinkonzentration eine zunehmend relativ größereTab. lExtinktionen bei 644 (10 mm) von 8 mg% Bilirubin bei Ansätzenmit verschiedenen Chargen des Reagenz nach FERRO und HAMVersuch- EiweißNr. 3(2,7—3,1) g% 6(5,4 6,2) g «/o0,3920,2650,2960,3480,3090,2160,2600,331wossrigeLösung>·- Jendross'ik- >*· u,Cleghorn^ ^B 13 16 0mg % Bilirubin8 K 16Abb. lDas Verhalten der Extinktion bei steigender Bilirubin-Kon2en-tration in Lösungen verschiedenen EiweißgehaltesLinks: Methode nach FERRO und HAM; rechts: nach JENDRASSIKund CLEGHORNMenge Bilirubin nicht als Farbkomplex in der gemesse-nen Phase erscheint. Offenbar wird, wie es auch die blau-grüne Färbung des Niederschlags ausweist, eine jedenfallsnicht der Konzentration proportionale Menge des Farb-stoffs an den Eiweißniederschlag adsorbiert und somitder Messung entzogen. Gleichzeitige Bestimmung ausdem gleichen Ansatz nach JENDRASSIK und CLEGHORNergab dagegen einen linearen, der jeweiligen Bilirubin-konzentration entsprechenden Anstieg der Extinktion.Die Methode nach FERRO und HAM besticht durch ihreEinfachheit und durch die Stabilität der Farbe, wenn auchdie Inkubationsdauer von 20 Min. gegenüber derDiazomethode keinen Zeitgewinn einbringt. Aber wiebei allen Methoden zur Bilirulbinbestimmung, die mitEiweißfällung arbeiten, ist die Adsorption des Farb-stoffes an den Niederschlag ein entscheidender Nachteil,der die Methode mit einem zu großen Fehler belastet.Gerade beim Neugeborenen kann die Serumeiweiß-konzentration innerhalb eines relativ großen Bereichesschwanken, so daß hier die Fehler nicht mehr kon-trollierbar werden.Leider kann somit nach den vorliegenden Ergebnissendie Methode der Bestimmung des gesamten Bilirubinsnach FERRO und HAM nicht empfohlen werden.Literatur1. FERRO, P. V. und A. B. HAM, Amer. J. Clin. Path. 40, 209(1963). — 2. FERRO, P. V. und A. B. HAM, Amer. J. Clin. Path. 44,111 (1965). — 3. SCHELLONG, G. und U. WENDE, Klin. Wschr. 38,703 (1960). -- 4. WITH, T. K., Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem.278, 133 (1943).Priv.-Do£. Dr. rned. E. Gladtke,63 Gießen, Gutenbergstr. 24Z. kiin. Chem. ü. klin. Biochem./5. Jahrg. 1967/Heft 2

Die Bilirubinbestimmung nach FERRO und HAM im Serum

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