Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Doi
Abstract
Das COP9 Signalosom (CSN) ist ein hoch konservierter Proteinkomplex, der an der Regulation des Ubiquitin (Ub)-26S Proteasomsystems (UPS) beteiligt ist. Das UPS ist die wichtigste Proteolysemaschinerie in eukaryotischen Zellen, bei der Proteine über eine dreistufige Kaskade der Enzyme E1-E3 mit einer Ub-Kette markiert werden, die als Erkennungssignal für den Abbau durch das 26S Proteasom dient. Das CSN gilt als Paralog zum Lid, einem Subkomplex des 26S Proteasoms, und interagiert mit einer Vielzahl von Proteinen, unter anderem mit E3-Ligasen und Kinasen. In dieser Arbeit konnte die direkte Bindung des CSN an das 26S Proteasom gezeigt werden, was zu einem Einfluss auf die Peptidaseaktivität des 26S Proteasoms in vitro führt. In Flag-Pulldown-Experimenten aus B8 Mausfibroblasten, die stabil mit Flag-CSN2 transfiziert waren, wurde ein vollständiger Flag-CSN-Komplex nachgewiesen, der mit dem 26S Proteasom assoziiert vorliegt. Co-Immunpräzipitationen beider Komplexe in vitro wiesen auf eine konzentrationsabhängige Verdrängung des Lid-Subkomplexes durch das CSN hin. Diese Interaktion führte zur Reduktion der proteolytischen Aktivität des 26S Proteasoms. Darüber hinaus wurde eine assoziierte deubiquitinierende Aktivität am CSN entdeckt und als USP15 identifiziert. Die Charakterisierung von USP15 zeigte, dass es durch die am CSN assoziierte Kinase CK2 phosphoryliert und stabilisiert wird. Erstmalig konnte durch Inhibitorstudien mit ortho-Phenanthrolin eine Metallabhängigkeit der Aktivität von USP15 nachgewiesen werden, die zur Identifizierung eines bisher unbekannten Zn-Fingers führte. Mutationsanalysen des Zn-Fingers zeigen, dass dieser für die Bindung und Spaltung von Ub-Ketten, nicht aber von linearen Ub-Konstrukten, notwendig ist. In Zellexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass USP15 die E3 Ligase Rbx1 stabilisiert, was vermutlich auf eine Umkehr der Autoubiquitinierung zurückzuführen ist. Das CSN scheint somit sowohl das 26S Proteasom als auch die E3-Ligasen direkt zu beeinflussen. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen eine Vertiefung der Erkenntnisse über das CSN als Regulator des UPS dar.The COP9 signalosome (CSN) is a conserved protein complex that is involved in the regulation of the ubiquitin (Ub)/26S proteasome system (UPS). The UPS is the most important degradation machinery in eukaryotic cells. By the concerted action of three enzymes, E1-E3, proteins are labelled with a Ub-chain that serves as a recognition signal for the degradation by the 26S proteasome. The CSN is homologous to the lid, a subcomplex of the 26S proteasome, and interacts with numerous proteins, including E3 Ub ligases and kinases. In this study a direct interaction of the CSN with the 26S proteasome could be shown which has consequences for the peptidase activity of the 26S proteasome in vitro. In Flag-pull-down experiments from mouse B8 fibroblasts, that permanently expressed Flag-CSN2, an intact Flag-CSN complex was detected that is associated with the 26S proteasome. Co-immunoprecipitation of both complexes in vitro indicated a concentration-dependent replacement of the lid subcomplex by the CSN. This interaction led to a decrease of the proteolytic activity of the 26S proteasome. Moreover, a deubiquitinating activity associated with the CSN was discovered and identified as USP15. The USP15 was phosphorylated by the CSN-associated kinase CK2 that stabilised the enzyme. For the first time inhibitor studies with ortho-phenanthroline demonstrated a metal-dependency for the activity of USP15 that could be attributed to a formerly unidentified Zn-finger. Mutational analysis of the Zn-finger showed that it is necessary for the binding and cleavage of poly-Ub-chains but not for linear Ub-constructs. Cell culture experiments demonstrated a stabilisation of the E3 ligase Rbx1 by USP15 most likely by reversing its autoubiquitination. Therefore the CSN seems to directly influence the 26S proteasome as well as E3 ligases in their functions. These results expand the present knowledge on the CSN as a regulator of the UPS
