Sintesi e caratterizzazione di nuovi derivati della creatina per la terapia del deficit del trasportatore SLC6A8 e nuova procedura sintetica per l'ottenimento della fosfocreatina

Abstract

Parte 1 Il Deficit del trasportatore della creatina \ue8 una rara malattia genetica dovuta al malfunzionamento della proteina denominata SLC6A8 e deputata al trasporto della creatina attraverso le barriere biologiche. Il mancato funzionamento del trasportatore della creatina comporta l\u2019assenza di creatina a livello cerebrale con la conseguenza di gravissimi danni neurologici. La creatina infatti \ue8 una molecola polare che attraversa le barriere biologiche solo per mezzo del suo trasportatore. Ad oggi non esiste nessuna terapia per tale patologia. Una possibilit\ue0 terapeutica potrebbe essere rappresentata da profarmaci della creatina in grado di attraversare le membrane cellulari e la barriera ematoencefalica (BEE) in modo indipendente dal trasportatore della creatina stessa. Questo potrebbe ripristinare il contenuto di creatina all'interno delle cellule nervose. Per raggiungere tale scopo, in questo progetto di tesi, si sono messe a punto due diverse strategie di sviluppo di derivati della creatina: 1. modificare la struttura della creatina in modo tale da ottenere una molecola maggiormente lipofila che possa attraversare le membrane biologiche per diffusione passiva. 2. realizzare derivati ottenuti dalla coniugazione della creatina con molecole che possano utilizzare un trasportatore diverso dall\u2019SLC6A8. I derivati sintetizzati secondo tali strategie sono stati ottenuti in buona resa e caratterizzati mediante HPLC e spettrometria di massa; alcuni di loro sono stati anche valutati dal punto di vista della stabilit\ue0 in mezzo fisiologico e degli effetti neurobiologici.Parte 2 La fosfocreatina esogena viene prodotta con il nome di \u201cNeoton\u201d dalla casa farmaceutica Alfa Wasserman S.p.A. (Italia), e fa parte del gruppo di farmaci metabolici utilizzati nella protezione del miocardio in aggiunta alle soluzioni cardioplegiche. La fosfocreatina infatti esercita un duplice effetto che la rende un potenziale agente terapeutico cardioprotettivo: l\u2019attivit\ue0 di conservazione dell\u2019energia miocardica mediante il ripristino delle riserve di ATP e l\u2019azione protettiva verso le membrane biologiche. Quasi tutti i metodi pubblicati finora per la sintesi della fosfocreatina portano nella maggior parte dei casi ad una molecola ottenuta in bassa resa e dopo molteplici step di purificazione.La bassa resa \ue8 dovuta ad una scarsa reattivit\ue0 dell\u2019agente guanilante utilizzato, soprattutto quando esso \ue8 costituito da un derivato della cianoammide. Parte del lavoro svolto ha riguardato la messa a punto di una metodica alternativa ai metodi convenzionali che ha permesso di ottenere la fosfocreatina in buona resa e purezza.Part 1 Creatine transporter deficiency is a rare hereditary disease due to the loss of function of the SLC6A8 (creatine transporter). Creatine is a polar molecule, able to cross the biological barriers exclusively using its own transporter and therefore this disease causes the lack of cerebral creatine and leads to dramatic neurological symptoms. To date there is no therapy available for this disorder. A therapeutic strategy could be represented by creatine prodrugs able to cross the cellular membranes and the blood brain barrier (BBB) in an independent way from using the creatine transporter and releasing creatine once inside the cells to exert its biological activities. Two different strategies have been developed to synthesized creatine derivatives: 1.The modification of the creatine molecular skeleton in order to obtain more lipophilic prodrugs that could cross the BBB and the biological membranes by passive diffusion. 2. The conjugation of creatine with a molecule able to exploit a different transporter than SLC6A8, i.e. the glucose transporters, creating a chimeric molecule able to use an alternative way The synthesized derivatives have been obtained in high yield and purity and characterized by means of HPLC and mass spectrometry. Some of them have been evaluated for their stability in physiological conditions and neurobiological effects.Part 2 The exogenous phosphocreatine is currently marketed as \u201cNeoton\u201d by Alfa Wasserman Industry S.p.A. (Italy) and is part of the therapy in the myocardial protection in addition to the cardioplegic solutions. Phosphocreatine exerts a twofold effect as a cardioprotective agent: the regeneration of the ATP reserves and the protective effects of the biological membranes. Most of the methods published so far to synthesize phosphocreatine lead to a low-yielded molecule and involve several purification steps. Low yield is due to the poor reactivity of the guanilating agent used, especially when it is a cyanamide derivative. Part of this job was to develop an alternative method to conventional methods ,that allowed to obtain phosphocreatine with good yeld and purity