Gerretsen, F.C.

Grijns, A.

Sack, J.

Söhngen, N.L.

Dutch

NARCIS 

Het voorkomen van een bacteriophaag in de wortelknolletjes der Leguminosen

Wageningen Yield 

RIJKSLA.NDBOUWPROEFSTATION GRONINGEN. 
Het voorkomen van een bacteriophaag in de wortel-
knolletjes der Leguminosen 
DOOR 
F. C. GERRETSEN, A. GRIJNS, J. SACK en N. L. SÖHNGEN. 
(Ingezonden 11 September 1923). 
Binnen de wortelknolletjes van de Leguminosen worden de 
bacteriën op een tot nu toe onbekende wijze opgelost; de mogelijk-
heid bestond, dat deze oplossing geschiedde door tusschenkomst 
van een z.g.n. bacteriophaag *). 
Bij een onderzoek in deze richting werd het voorkomen van een 
bacteriophaag in de leguminosenknolletjes door CTBRRETSBN en SACK 
(Afd. Microbiologie Hij kslandbouwproef station) te Groningen en 
SÖHNGEN en GKIJNS (Microbiologisch Laboratorium Landbouwhooge-
school) te Wageningen onafhankelijk van elkaar vastgesteld. Een 
onderhoud over dit onderwerp deed ons besluiten de analoge en 
elkaar aanvullende resultaten gezamenlijk te publiceeren. 
Voor ons onderzoek werd uitgegaan van volwassen planten 
van klaver, lupinen en Serradella; de knolletjes werden gedurende 
15 min. gesteriliseerd met sublimaat (1 : 1000) en herhaaldelijk 
afgespoeld met alcohol en steriel water. Daarna werden ze met 
een steriel mes doorgesneden en de inhoud over een agarplaat 
uitgestreken of wel met een steriele pincet fijngeknepen en in 
de agar opgeschud. 
De gebruikte voedingsbodems bestonden uit een extract van 
gekiemde groene erwten (of ook wel jonge klaverplanten) met 
ly2 pet. agar of 12 pet. gelatine, zwak alcalisch gemaakt t.o. 
van phenolphtaleine. Daarnevens werd met goed gevolg gebruik 
gemaakt van een oplossing van manniet 1 pet., NaN03 0,05 pet., 
!) Zooals bekend bestaat het zgn. Twort-d'Herell'sche phenomeen daarin dat bepaalde 
bacteriën, zoowel in cultuurvloeistof als op de plaat uiteenvallen en geheel in oplossing 
gaan; het lytische agens is filtreerbaar en door d'Herelle wordt verondersteld dat 
het een levende ultramicrobe is, (Bacteriophaag), die onder zekere voorwaarden de 
bacteriën aantast en oplost. 
I 
(KsHPO,! 0,05 pet. in leidingwater, al of niet gestold met 
lV's pet. agar. 
In het algemeen komen op deze voedingsbodems de koloniën 
regelmatig op; wel viel het op, dat somtijds rondom stukjes van 
het knolletje een steriel veldje van 1 à 2 c.M. middellijn ontstond. 
Daar deze veldjes achterwege bleven, wanneer niet met sublimaat 
was gesteriliseerd, is hier van een bacteriophaagwerking geen 
sprake en is het waarschijnlijk dat ook bij uiterst zorgvuldige 
afwassching een gedeelte van de sublimaat door den celwand ge-
adsorbeerd wordt, welke sublimaat echter in aanraking met een 
ander colloid, i. c. agar of gelatine, weer wordt afgestaan. Ook 
is het niet waarschijnlijk dat in de wortelknolletjes in het alge-
meen de bafteriophaag in zeer geconcentreerden toestand voorkomt, 
daar noch het extract van lupineknolletjes op een plaat met 
Bac. Radicieola lupine een oplossingveld doet ontstaan, noch een 
extract van klaverknolletjes op een plaat met Bac. rad. klaver 
den groei ook maar eenigszins belemmerde. 
Ter verkrijging van de bacteriophaag werden de knolletjes, na 
sterilisatie, fijngewreven in een steriel mortier en gemengd met 
voedingsvloeistof. Na een vijftal dagen werd de troebele vloeistof 
door een bougiei gefiltreerd, van het heldere filtraat eenige c.c. 
gevoegd aan nieuwe cultuuroplossing en deze geënt met de be-
treffende bacterie. Dit werd een keer of tien herhaald, soms 
meer, terwijl telkenmale de hoeveelheid filtraat, die aan de vloei-
stof werd toegevoegd, verminderd werd, zoodat ton laatste nog 
slechts enkele platinadraad-oogjes vol gebruikt werden. 
In den loop van het onderzoek bleek, dat herhaalde malen 
filtreeren en cultiveeren de zekerste weg is om krachtige werk-
zame bacteriophages ta krijgen. 
Werd nu van de bacteriophaaghoudende vloeistof een weinig 
gebracht in een voedingsoplossing, die mot Bac. rad. geënt was, 
dan werd meestal na oenigo dagen do vloeistof troebel om eerst 
daarna op te helderen (fig. 1). 
Van het tijdstip van enten totdat een goode lyse plaats gehad 
had gingen gewoonlijk tien dagen heen. 
Soms gebeurde het echter dat in de vloeistof, waaraan de 
bacteriophaag was toegevoegd, na enting met de betreffende bac-
teriën, geen groei meer plaats had. Ook was het in een aantal 
gevallen mogelijk om goed gegroeide oudere cultures door toe-
voeging van de bacteriophaag geheel in oplossing te brengen. 
Kenmerkend, vooral in het laatste geval, is het strooprig worden 
van de vloeistof na de lyse. 
Ter aantooning van do bacteriophaag kregen wij in de meeste 
gevallen een beter on sneller resultaat door de bacteriophaag-
houdende vloeistof uit te strijken op een agarplaat en hierover-
heen met de bijbehoorende bacterie te enten. De met de bacte-
riophaag bestreken plaatsen bloven dan steriel, zooals uit de foto 
duidelijk blijkt (fig. 2). 
Het was van belang te weten of de bacteriophaag, verkregen 
Fig. 1. — Cultuur van Bac. radicicola klaver in manniet 
nitraat leidingwater. Links zonder bacteriophaag 
rechts met bacteriophaag, na afloop der lyse. 

Fig. 2. — Cultuur van Bac. rad. uit lupinen en Serradella. Links normaal, rechts 
nadat de plaat met de Serradella bacteriophaag bestreken is. Hier groeit 
de Serradella bacterie niet meer, wel de lupine bact. 
Fig. 3. — Cultuur van twee verschillende stammen van Bac. rad. Serradella. 
Links normaal. De rechtsche plaat is met een bacteriophaag bestreken. De 
bijbehoorende stam groeit niet, de andere stam groeit ongestoord. 

3 
uit een bepaalde leguminose, ook lytisch werkt op de bacteriën 
van andere leguminosen. De serradellabacteriophaag werd onder-
zocht t.o. van de bacteriën van lupinen, wikke, erwten, duiven-
boonen, klaver en esparcette, maar van een oplossende werking 
was niets te bespeuren (fig. 3). 
Do Bac. rad. uit boonen werd daarentegen door de klaver-
bacteriophaag langzaam aangetast, die uit lupinen niet. Evenmin 
werkte de bacteriophaag uit de lupinen op Bac. rad. uit klaver 
en boonen. Ook Bac. coli, Azotobacter chroococcum. Radiobacter, 
Bac. fluorescens liq. en Bac. violacius werden geen van alle door 
do lupinen- of klaverbacteriophaag aangetast. 
Wij zien hier dus een sterk uitgesproken specificiteit, die nog 
duidelijker uitkwam bij de volgende proef. Ten einde n.1. onze 
serradellabacteri© te vergelijken met een van andere herkomst 
was een reincultuur aangevraagd uit PRIBAM'S (voorheen KRAL'S) 
verzameling te Weenen. 
De ontvangen cultuur groeide heel slecht, wat het vermoeden 
deed ontstaan dat zij reeds een bacteriophaag bevatte. Na over-
enting in cultuurvloeistof en herhaaldelijk filtreeren bleek dit 
indordaaö het geval te zijn1). 
Het merkwaardige was echter, dat de bacteriophaag afkomstig 
uit deze reincultuur niet lytisch werkte op de door ons geïso -^
leerde serradellabacterie en omgekeerd onze bacteriophaag niet 
op do Serradella van PRIBAM. Een dergelijke specifieke werking 
van de bacteriophaag t.o. van verschillende stammen van dezelfde 
baeteriënsoort vinden wij: o.a. ook bij KlJTTNER2) ein JANSEN on 
WOLFF 8), waar de typhusbacteriophaag groote verschillen in werk-
zaamheid vertoonde t.o. van typhusbacteriën van verschillende 
herkomst. 
In verband met het voorkomen van de knolletjcsbaeteriën binnen 
het celweefsel van de plant was hot van belang te weten in 
hoeverre de bacteriophaag in staat zou zijn door een membraam 
heen te diffundeoren. Hiertoe werd een weinig van de bacte-
riephaaghóudende vloeistof in een collodiumzakje gedaan en dit 
gehangen in een buisje met gedestilleerd water, dat zwak alcalisch 
was gemaakt en waaraan wat lactose* was toegevoegd om te voor-
komen dat er een te groot verschil in osmotischen druk tusschen 
de vloeistof binnen en buiten het collodiumzakje zou bestaan. 
!) Tal van andere onderzoekers (o.a. B A I L . Wiener Klin. Wochenschr. 34, blz. 447 — 449, 
O T T O en M U N T E R , Deutsehe Med Wochenschr. 47, blz. 1579 K U T T N E R , Journal Bact. 
V I I I , blz. 81) isoleerden bacteriophagen uit oude zoowel als jonge reinculturen. He t 
komt ons voor dat men hieruit in geen geval besluiten mag dat de bacterieophaag 
ontstaat uit de bacteriën zelf en de aanname van d'Hérelle, dat het een ultramicrobe is, 
overbodig is. Integendeel, wanDeer het een ultramicrobe is, spreekt het vanzelf dat het 
even lastig is een bacterie bacteriophaag-vrij te krijgen, als een hooger organisme 
bacterievrij. Ook de door K U T T N E R (I.e. blz. 99) voorgeslagen cultuur uit één cel geeft 
geen enkele garantie dat daarop geen bacteriophaag aanwezig is. 
2) Journal . Bact. V I I I , blz. 94. 
8) Nederl. Tijdschr. v. Geneesk. J a a r g . 1922, blz. 1820. 
Het bleek dat alleen bij gebruik van zeer dunne collodium-
zakjes de bacteriophaag naar buiten diffundeerde, terwijl door 
een dikkeren wand alles werd tegengehouden. Dit is in overeen-
stemming met de onderzoekingen van D'HËRELLE1), die vond dat 
de bacteriophaag slechts colïodiummembramen kon passeeren, 
welke voor eiwitmoleculen doorlatend zijn. De mogelijkheid dat 
deze bacteriophaag door dunne celwanden heengaat is hiermede 
aangetoond, zoodat het niet uitgesloten is dat men de bacte-
riophaag ook vindt in de plant zelf op plaatsen waar geen bac-
teriën aanwezig zijn. Het bleek inderdaad mogelijk om de bac-
teriophaag te isoleeren uit de wortels van klaverplantjes, waarvan 
de knolletjes zorgvuldig waren verwijderd, terwijl de wortels met 
sublimaat en alcohol waren gesteriliseerd. Ook was het mogelijk 
om de bacteriophaag uit de stengels te halen, waarbij drie van 
do zeven proeven positief uitvielen. Met de bladeren waren alle 
zes proeven negatief. Wanneer in den celwand en binnen in de cel 
eenmaal de bacteriophaag aanwezig is, dan is het aannemelijk 
dat deze voor de betreffende bacteriën onaantastbaar is geworden 
(vooral ook gezien de resultaten van de afstrijkingsproeven in 
fig. 2). Tevens kan dit wellicht een verklaring zijn voor het feit 
dat niet het geheele wortelstelsel door de bacteriën wordt aan-
getast, doch deze zich slechts plaatselijk kunnen ontwikkelen. 
Ook kan de bacteriophaag geïsoleerd worden uit cultuurgrond 
(tuin- en akkergrond) mits een hoeveelheid van minstens 1.00 gram 
in bewerking werd genomen. Met heide- en boschgrond waren 
alle zes proeven negatief. 
Het is waarschijnlijk dat de aanwezigheid van de bacteriophaag 
in den grond direct verband houdt met het al of niet aanwezig 
zijn van Bac. rad. In hoeverre de sterke specificiteit van deze 
bacteriophaag oen bezwaar zal zijn om uit haar aanwezig zijn 
in den grond indirect tot de aanwezigheid der betreffende legu-
minoscbacterie te kunnen besluiten, moet nog door nadere proeven 
wordeii uitgemaakt. 
In dit verband was het van belang na te gaan of de bac-
teriophaag tegen uitdrogen bestand is. Een hoeveelheid bacterio-
phaaghoudende vloeistof werd in een reep filtreerpapier opge-
zogen. Om te voorkomen dat bij het opdrogen de concentratie 
van de aanwezige zouten zóó hoog wordt, dat hierdoor de bac-
teriophaag geschaad wordt, werd het filtreerpapier met een punt 
in gedestilleerd water gehangen, waarbij heel langzaam een deel 
der zouten uit het papier diffundeerde. Eerst daarna werd het 
papier in den exsiccator boven chloorcalcium gedroogd. De bac-
teriophaag behoudt gedroogd zijn werkzaamheid gedurende min-
stens twee maanden. Ten slotte werd nog nagegaan hoe de 
bacteriophaag- zich gedraagt zoowel t.o. van verwarming als t.o. 
van bestraling met ultra violet licht. 
l Der Bacteriophage, 1922, blz. 81. 
Ter bepaling van do temperatuur, -waarbij de bacteriophaag 
haar werkzaamheid verliest, werd de bacteriophaaghoudende vloei-
stof in dunwandige capillaire buisjes opgezogen ; nadat deze waren 
dichtgesmolten werden zij geheel in water van bepaaldei tempe-
ratuur gedompeld. Het bleek dat de serradella-bacteriophaag haar 
werkzaamheid verliest, wanneer zij gedurende een half uur bij 
60° verhit is geworden. Deze temperatuur is betrekkelijk laag 
vergeleken bij die, welke andere onderzoekers opgeven. Zoo geeft 
D'HÉRELLE1) aan dat nog 65° verdragen wordt, DAVISON2) ver-
warmt tot 67°, terwijl ook de klaver- en lupinen-bacteriophagen 
tegen hoogere temperatuur kunnen en een verwarming tot op 65° 
gedurende 15 min. kunnen verdragen. 
De" invloed van de bestraling met het U. V. licht werd op 
twee wijzen nagegaan, n.1. op agarplaten, welke met bacteriophaag-
houdende vloeistof bestreken waren en in vloeistofcultures. De 
platen werden op 30 c.M. afstand van de kwartslamp (4 Amp. 
220 V. Heraeus) aan het . ultra violette licht blootgesteld ge-
durende 5, 15 en 30 minuten en daarna bestreken met een serra-
dellacultuur. Op geen der platen had groei plaats, waaruit blijkt, 
dat in dezen tijd de bacteriophaag nog niet door de bestraling 
had geleden. Ten overvloede werd nog nagegaan of er in de 
platen tengevolge van de bestraling geen chemische stoffen ge-
vormd waren, die voor de bacteriën schadelijk waren, hetgeen 
niet het geval bleek. 
Verder werd de bacteriophaaghoudende vloeistof in een dunne 
laag aan het U. V. licht blootgesteld gedurende 15 en 30 min. 
Hiertoe werd in een kwartsbuisje oen tweede buis van glas ge-
daan, zoodat tusschen beide buizen slechts een ruimte van enkele 
millimeters overbleef, welke met bacteriophaaghoudende vloeistof 
gevuld werd. 
Daar op deze wijze slechts de voorste helft van de vloeistof-
kolom bestraald werd, werd de buis geregeld gedraaid en de 
belichtingstijd voor de helft in rekening gebracht. 
Daar de bestraling gedurende 30 min. de bacteriophaag niet 
schaadde, werd de proef herhaald met een langere belichting. 
Hierbij bleek dat na twee uur (netto) bestraling do bacteriophaag 
nog intact was, doch na twee en een half uur onwerkzaam was 
geworden. 
Ook GILDEMEISTER 3) geeft aan dat de door hem onderzochte 
bacteriophaag, welke op een afstand van enkele centimeters van 
de lamp gedurende 30—40 min. bestraald werd, soms nog werk-
zaam was. Vergelijken wij dit met de resistentie van bepaalde 
enzymen, dan blijkt dat naar gelang van hun aard de gevoelig-
heid dermate uiteenloopt, dat uit den tijd, waarin de bacteriophaag 
haar werkzaamheid verliest, geen conclusies te trekken zijn aan-
i) 1. c. blz. 15. 
*) Journ. Bact. Vol. VII, blz. 482. 
S) Jour. Bact. VIII, blz. 99. 
6 
gaande het al of niet enzymatisch karakter. "Wel is het merk-
waardig1 dat de bacteriophaag na twee uur bestraling nog on-
veranderd, is, terwijl de serradellabacteriën zelf reeds binnen 
15 minuten, gedood zijn. 
Volgens KUTTNER1) zou de bacteriophaag een autolysine zijn, 
waardooi het evenwicht tusschen de opbouwende en afbrekende 
krachten in de cel ten gunst« van de laatsten verstoord zou 
worden De cel lost dientengevolge op en er komt op die wijze 
steeds meer autolysine vrij. 
Bij do bestraling met het U. V. licht blijkt de reproductie — 
d. i. de opbouwende! functie — veel gevoeliger te zijn dan de 
bacteriophaag (of het z.g.n. autolysine') en het ligt alzoo voor 
da hand dat na de bestraling de bacteriën, waarin dus de op-
bouwende functie verstoord is en het autolysine intact is ge-
bleven, door dit autolysine na korteren of längeren tijd worden 
opgelost2). Daar dit niet het geval is, komt het ons voor dat 
de theorie van KUTTNER niet houdbaar is. De theorie van L'HÉRELLE 
daarentegen, waarbij de bacteriophaag beschouwd wordt als een 
ultramicrobe, die slechts onder bepaalde voorwaarden zich in, 
liefst jonge, levende microben ontwikkelt, is met het bovenstaande 
niet in strijd. 
E es um é. 
Uit de wortelknolletjes van klaver, lupine en Serradella werd 
bacturiophagen geïsoleerd en daarmede mogelijk oen verklaring 
gevonden voor do wijze, waarop binnen de wortelknolletjes de 
bacteriën in oplossing worden gebracht. • 
Deze bacteriophagen zijn zeer specifiek in hun lytische wer-
king ; zij tasten in het algemeen slechts de bacteriën aan, die 
do wortelknolletjos van de betreffende leguminosen vormen. 
De bacteriophagen werden ook geïsoleerd uit de wortels en 
de stengels-; der leguminosen, niet echter uit de bladeren. 
Uit tuin- en akkergrond, niet uit heide- en boschgrond konden 
do leguminosenbacteriophagcn geïsoleerd worden. 
De bacteriophagen zijn, naar gelang van hun soort, bestand 
tegen verhitting gedurende 15 min. op 60°—65°, zijn bestand 
tegen uitdrogen en passeeren dunne collodiumhuidjes. 
De resistentie van de bacteriophagen t.o. van ultra violet licht 
is minstens achtmaal erooter dan van de betreffende bacteriën. 
i) Jour . linet. V I I I , blz. 99. 
2) P e autolyse van celweefsels wordt volgens OPPENHEIMER, (die Fermente 1913 blz. 
504) zoowel door radium als Böntgen bestraling bevorderd. 


http://library.wur.nl/WebQuery/wurpubs/fulltext/359059

Het voorkomen van een bacteriophaag in de wortelknolletjes der Leguminosen

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

NARCIS

Wageningen Yield