Dynamik und Regulation der metabolischen Balance in Escherichia coli K-12: Molekularbiologische Charakterisierung peripherer und artifizieller Regulationsmechanismen des Glukose-Phosphotransferase-Systems

Abstract

Bakterien wie Escherichia coli sind immer wieder wechselnden Umweltbedingungen und Nährstoffen ausgesetzt. Aus diesem Grund zeigen sie eine starke Regulation des Kohlenstoff-Metabolismus, um stets die am besten geeignete Nährstoffquelle nutzen zu können. Das Glukose-Phosphotransferase-System (PTS) stellt in E.coli das Hauptaufnahmesystem für Glukose dar und unterliegt damit einer besonderen Regulation. Die Untersuchung der Regulation des Glukose-PTS durch das kleine regulatorische Peptid SgrT war ein Hauptaspekt in dieser Arbeit. Das so genannte SgrRST-System wurde bereits von anderen Arbeitsgruppen als verantwortlich für die Regulation der Expression und Aktivität des Glukose-Transportproteins EIICBGlc (Gen ptsG) unter Glukose-6-Phosphatstress identifiziert. Sie konnten einen durch SgrR aktivierten und durch sgrS (sRNA) vermittelten spezifischen Abbau der ptsG-mRNA zeigen und zudem das von sgrS kodierte Protein SgrT nachweisen (Wadler und Vanderpool, 2007). Dabei waren der Mechanismus und die Funktion von SgrT bei der Regulation des Glukose-PTS bislang unklar. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal eine direkte Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen SgrT und dem Membranprotein EIICBGlc durch in vitro- und in vivo-Methoden nachgewiesen werden. Dabei wurde nicht nur der Nachweis einer Wechselwirkung erbracht, sondern es konnte auch auf Seiten des EIICBGlc eine für die Interaktion der beiden Proteine essentielle Region identifiziert werden. Im hoch konservierten KTPGRED-Motiv des Linkers, welcher die membranständige EIICGlc- und die cytoplasmatische EIIBGlc-Domäne flexibel miteinander verbindet, wurden die Aminosäuren T383, P384, G385, R386 und E387 als Interaktionspartner für SgrT nachgewiesen. Damit wurde der in allen Enterobakterien vorkommenden Sequenz des Linkers in den Glukose- und N-Acetyl-Glukosamin-spezifischen Transportproteinen zum ersten Mal eine Funktion zugewiesen. Zudem wurde ein Modell entwickelt, welches die Funktionsweise von SgrT verdeutlicht. Durch die Bindung des Linkers und die damit verbundene Verhinderung der zum Glukose-Transport notwendigen Konformationsänderung des EIICBGlc, setzt SgrT die Transportaktivität des Membranproteins unter Glukose-6-Phosphatstress drastisch herab. Im Rahmen des FORSYS-Partner Projektes wurde zudem die Auswirkung des SgrRST-Systems auf die Aufrechterhaltung der metabolischen Balance von E.coli in Fermentationsversuchen untersucht. Ein zweites Projekt dieser Arbeit befasste sich mit der Auswirkung der Expression eines chromosomal kodierten EIICBGlc-His auf das Wachstum verschiedener Stämme. Es konnte erfolgreich ein Stamm mit einem ptsGHis-Gen im Chromosom konstruiert und in verschiedenen Versuchen auf z.B. Transportaktivität und Wachstum getestet werden. Des Weiteren wurde ein Stamm mit einem chromosomal kodierten EIICBGlc-His unter der Kontrolle des tacPO kloniert. Durch gezielte IPTG-Zugabe ist das Expressionslevel einstellbar und könnte so in verschiedenen Versuchsansätzen zur Analyse der Auswirkung auf den Metabolismus der Zelle dienen. Auf Grund einer geringen Transportaktivität dieses Stammes wurde eine Suppressionsmutante isoliert, welche einen verstärkten Transport zeigt, bei der sich jedoch das Expressionslevel des EIICBGlc-His nicht mehr vollständig herabsetzen lässt. Eine Optimierung beider Stämme ist demnach erforderlich