Hintergrund: Sauerstoff ist für den Energiestoffwechsel nahezu aller eukaryotischen Lebewesen essentiell. Sauerstoffmangel (Hypoxie) stellt somit eine für das Überleben maßgebliche Veränderung dar, die zwingend einer Anpassung bedarf. Der Hypoxia Inducible Factor (HIF) ist ein Hauptmediator in Hypoxie. Er vermittelt u. a. die Anpassung der anaeroben Glykolyserate und die pH-Regulation. Episodische Hypoxie stellt eine Sonderform dar, die durch wiederkehrende Phasen aus Hypoxie und Reoxygenierung gekennzeichnet ist und bisher vorrangig im Kontext von kardiovaskulären Erkrankungen und obstruktiver Schlafapnoe untersucht wurde. Kürzlich wurde jedoch auch gezeigt, dass die Gabe des Immunsuppressivums Cyclosporin A (CsA) in der Niere eine episodische Hypoxie auslöst. Die hierbei aktivierten Signalwege unterscheiden sich deutlich von denen einer kontinuierlichen Hypoxie. Ziel dieser Arbeit war es, die zelluläre Anpassung an episodische Hypoxie mit Fokus auf der Aktivität von HIF in einem in vitro Modell zu untersuchen.
Methoden: Die in vitro Untersuchungen zur renalen episodischen Hypoxie erfolgten durch Inkubation von DCT- und HT1080-Zellen für 4 h pro Tag unter 1 % Sauerstoff über einen Zeitraum von 6 Tagen. Zum Vergleich dienten normoxische Kontrollzellen sowie eine einmalige Inkubation bei 1 % Sauerstoff für 4 h bzw. 24 h. Für die Untersuchungen zur HIF Aktivität wurden qPCRs ausgesuchter HIF Zielgene und Reportergen-Assays durchgeführt und HIF interagierende Faktoren quantifiziert. Mit Hilfe der Bisulfitkonversion erfolgten Analysen zum Methylierungsstatus hypoxieresponsiver Elemente in den Promotorregionen ausgewählter HIF Zielgene. Western Blot Analysen dienten zur Quantifizierung und subzellulären Lokalisierung von HIF-1a sowie dem Nachweis des Apoptose-Markers aktive Caspase-3. Intrazelluläre ROS Mengen wurden durch Behandlung mit 2‘7‘-Dichlorfluorescein-Diacetat-Assays bestimmt.
Ergebnisse: Im Zellmodell führte episodische Hypoxie zu stark erhöhten HIF-1a Proteinmengen, wobei eine erhöhte Expression von HIF-1 Zielgenen ausblieb. Die geringe HIF Aktivität in episodischer Hypoxie korrelierte mit einer beeinträchtigten nukleären Translokation von HIF- 1a, nicht jedoch mit einer HRE-Methylierung in Promotorregionen getesteter HIF Zielgene. Die HIF Kofaktoren Ep300 und Cited-2 zeigten keine Expressionsänderung auf mRNA-Ebene. Episodische Hypoxie führte gegenüber Kurz- und Langzeithypoxie zu einem veränderten zellulären Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und schützte vor einer Staurosporin induzierten Apoptose.
Schlussfolgerung: Episodische Hypoxie im Zellmodell bildet das weitgehend HIF unabhängige Transkriptom wiederholter CsA-Gaben in vivo nach. Die Hemmung der HIF Aktivität wird durch eine unzureichende nukleäre HIF-1a Translokation erzeugt. Die zelluläre Anpassung an episodische Hypoxie erfolgt demnach scheinbar HIF unabhängig. Hingegen scheint die tägliche Wiederholung von Hypoxie/Reoxygenierung eine Aktivierung zellulärer Schutzmechanismen hervorzurufen, die gegen Zellstress und Apoptose schützen, wobei moderat erhöhte ROS Mengen vermutlich als Signalgeber fungieren. Parallelen zu dem als „Präkonditionierung“ beschriebenen Phänomen müssen weiter untersucht werden.Background: During evolution, aerobic organisms developed numerous mechanisms to cope with hypoxia and ensure an adequate oxygen supply. As a key mediator of those adaptations, the hypoxia inducible factor (HIF) orchestrates a couple of processes such as a metabolic switch to anaerobic glycolysis and pH regulation. Episodic hypoxia is characterized by repetitive cycles of hypoxia and reoxygenation and has been mainly described in the context of cardiovascular diseases and obstructive sleep apnea. Recently, it has been shown that treatment with the immunosuppressant cyclosporine A (CsA) causes renal episodic hypoxia. Here we establish an in vitro model of episodic hypoxia to investigate the underlying signaling pathways, especially the HIF response.
Methods: DCT- and HT1080 cells were cultured under 4 h hypoxia (1% O2) for 6 daily courses to mimic episodic hypoxia. Cells grown in normoxia or short (4 h) and long-term (24 h) hypoxia served as controls. Reporter gene assays and qPCR measurements served for quantification of the transcriptional activity of HIF-1 and to scan for alterations in HIF co-transcription factors. Western Blot analyses were conducted to quantify and reveal the subcellular localization of HIF- 1a. Bisulfite conversion was performed to investigate the methylation status of hypoxia response elements of selected HIF target genes. Active Caspase-3, as a marker of apoptosis, was detected by Western blotting and intracellular ROS levels were detected in a 2’7’-dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) assay.
Results: In vitro, episodic hypoxia exhibited elevated HIF-1aprotein levels. However, transcriptional activity of HIF-1 was inhibited, which has been associated with impaired nuclear translocation of the HIF-1a subunit. In contrast, no alteration in HRE methylation of promoter regions of HIF target genes was found. Furthermore, no alteration was found in the expression level of HIF co-transcription factors Ep300 or Cited-2 at mRNA level. Following episodic hypoxia, cellular ROS levels were different compared to short- and long-term hypoxia and were associated with increased resistance to staurosporine-induced apoptosis.
Conclusion: In vitro, episodic hypoxia largely mimics the HIF independent renal transcriptome, that has been described following repetitive CsA application in vivo. Although HIF-1a protein levels are strongly elevated following episodic hypoxia, transcriptional activity of HIF is low due to an impaired nuclear translocation. Thus, the cellular adaptation to daily cycles of short hypoxic episodes seems to be HIF independent. However, episodic hypoxia activates protective mechanisms against cellular stress and apoptosis that seems to be mediated by moderately elevated ROS levels. Further investigations are needed to elucidate potential parallels to the “preconditioning” phenomenon
