Biological processes are often regulated by signal transduction pathway via transcription factor through protein-protein interactions (PPIs). Aberrant activation of transcription factor deregulates the cell signaling pathway which contributes to disease progression. Cancer is well characterized as a result of over activation of transcription factor and/or loss of an essential protein-protein interaction. Therefore, transcription factor have become attractive molecular target for drug development. Protein-templated fragment ligations have been established as a powerful method for the assembly and detection of optimized protein ligands. Initially developed for reversible ligations, the method has been expanded to irreversible reactions enabling the formation of super-additive fragment combinations. In this thesis, protein-induced Mannich ligations are introduced and discovered as a biocatalytic reaction furnishing inhibitors of the transcription factor STAT5. STAT5 protein was employed to catalyze multicomponent reactions of a phosphate mimetic, formaldehyde, and 1H-tetrazoles yielding protein ligands with greatly increased binding affinity and ligand efficiency. Reactions are induced under physiological conditions selectively by native STAT5 but not by other proteins. Formation of ligation products and (auto-) inhibition of the reaction are quantified and the mechanism is investigated. Inhibitors assembled by STAT5 were further validated using functional biochemical assay and were proven to block specifically the phosphorylation of this protein in a cellular model of acute myeloid leukemia (AML), DNA-binding of STAT5 dimers, expression of downstream targets of the transcription factor, and the proliferation of cancer cells in mice. In addition, STAT5 inhibitors also exert strong synergistic effect with tyrosine kinase inhibitor, PKC412 in targeting leukemic cells.
Throughout our effort in establishing highly selective STAT5 inhibitor, a first class of inhibitors that assembled through protein induced Mannich ligation reported to date have been successfully identified. STAT5 assembled inhibitors have proven to exhibit favorable potency and selectivity profile against STAT5 and possess the potential to become candidate for combination therapy with tyrosine kinase inhibitor for pre-clinical trials as STAT5 targeted therapeutic. Last but not least, these small molecules STAT5 inhibitors well served as a research tool to study the effect of knocking down of STAT5 function at the protein level on cancer prognosis and progression.Biologische Prozesse werden häufig über Signaltransduktionswege durch Transkriptionsfaktoren gesteuert und werden durch Protein-Protein-Interaktion (PPIs) vermittelt. Die abweichende Aktivierung eines Transkriptionsfaktors verändert den zellulären Signalweg, was zur Entwicklung oder zum Fortschreiten von Krankheiten beitragen kann. Krebs ist gut charakterisiert als das Ergebnis einer Überaktivierung von Transkriptionsfaktoren und/oder des Verlustes von essentiellen Protein-Protein-Interaktionen. Daher sind Transkriptionsfaktoren ein attraktives molekulares Ziel für die Arzneimittelentwicklung. Protein-templierte Fragment-Ligationen wurden als leistungsfähiges Verfahren zur Gewinnung und zur Erkennung von optimierten Protein-Liganden eingeführt. Ursprünglich entwickelt für reversible Ligationen wurde die Methode auf irreversible Reaktionen ausgeweitet und ermöglicht die Bildung von super-additiven Fragmentkombinationen. In dieser Arbeit werden protein-induzierte Mannich-Ligationen als eine biokatalytische Reaktion entdeckt, die Inhibitoren für den Transkriptionsfaktor STAT5 liefern. STAT5-Protein katalysiert Multikomponenten-Reaktionen eines Phosphat-Mimetikums, von Formaldehyd und von 1H-Tetrazolen, die Proteinliganden mit stark erhöhter Bindungsaffinität und Ligandeneffizienz liefern. Reaktionen werden unter physiologischen Bedingungen selektiv durch natives STAT5, aber nicht durch andere Proteine ausgelöst. Die Bildung von Ligationsprodukten und die (Auto-)Inhibition der Reaktion werden gemessen und der Mechanismus wird erforscht. Durch STAT5 gebildeten Inhibitoren werden weiter in funktionellen biochemischen Assays validiert und es wird gezeigt, dass sie spezifisch die Phosphorylierung dieses Proteins in einem zellulären Modell der akuten myeloischen Leukämie (AML), die DNA-Bindung von STAT5-Dimern, die Expression von Zielproteinen des Transkriptionsfaktors und die Proliferation von Krebszellen in Mäusen blockieren. Zusätzlich haben STAT5-Inhibitoren zusammen mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor PKC412 eine starke synergistische Wirkung auf Leukämiezellen. Wir haben die erste bisher bekannte Klasse von Inhibitoren identifiziert, die durch eine Protein-induzierte Mannich-Ligation gebildet wurden. Die durch STAT5 entstandenen Inhibitoren zeigen günstige Wirkungen und ein vorteilhaftes Selektivitätsprofil gegenüber STAT5 und besitzen das Potential, Kandidaten für eine Kombinationstherapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren für vorklinische Versuche als gezielte STAT5-Therapien zu werden. Zu guter Letzt dienten diese kleinen STAT5 Inhibitor-Moleküle als geeignete Forschungswerkzeuge, um die Effekte der Ausschaltung von STAT5-Funktionen auf die Prognose und den Verlauf von Krebserkrankungen zu untersuchen
