Background: Currently, no screening tool allows a precise estimate of the risk of progression towards dysplasia in cervical infections with the Human Papilloma Virus (HPV). HPV-infections are the main cause of cervical cancer. While 38% of women age 20-25 screen positive for HPV-infections, only a small percentage of these infections will develop towards dysplasia. Ideally, an HPV-based screening algorithm should differentiate transient HPV-infections from transforming ones. This project examines whether different stages of dysplasia induced by HPV infections can be characterized by means of biological markers. Secondly, this study evaluates of a new E7-based method of HPV-genotyping.
Methods: Quantitative mRNA-testing (QuantiGene ® 2.0 Assay) was performed for a panel of 23 cellular biomarkers and the oncogene E7 of 18 high-risk HPV-types for 218 cervical smears. Using branched-DNA-amplification and multi-analyte profiling beads, the targets were analyzed quantitatively with its sensitivity based on signal amplification. The results were recorded by a Luminex-readout and expression levels of each marker were relativized by the expression levels of Actin-b as a marker of cellularity. BSGP5+/6+-multiplex genotyping (MPG) was used as reference method for the evaluation of the new genotyping method. The correlation of biomarker expression with degree of dysplasia was calculated. Mathematical models based on expression-level cut-offs of the correlating biomarkers were established by the statistical methods of ROC-analysis and logistic regressions for relevant pathological thresholds.
Results: E7-mRNA-based HPV-genotyping showed identical results compared to the PCR-based MPG in 55,9% of the samples. 82,8% showed partially identical results (in multiple infection at least one matching HPV-type). In 88,9% of cases, the leading HPV-type in QuantiGene (strongest expression of E7) was also detected via MPG. The expression of the oncogenes E6 and E7, as well as of eight biomarkers were seen to significantly correlate with stages of dysplasia. By means of mathematical models based on expression levels of E7, ALDH1A1 and MCM2, the sample were correctly attributed over the threshold ≤CIN2/CIN3+ with an AUC of 0,903, a sensitivity of 86,9% and a specificity of 81,4%. The threshold of ≤CIN3/carcinoma was defined by expression levels of E7, STMN1 and KRT17 with an AUC of 0,913 (sensitivity: 85,2%, specificity: 77,2%).
Interpretation: As a pilot project this study shows that stages of cervical dysplasia can be defined as biological entities via molecular biomarkers. In a next step, reproducibility of the data and the significance of the biomarkers should be confirmed with a higher number of cases and a prospective design.Das Dysplasierisiko einer zervikalen Infektion mit dem Humanen Papillomvirus
(HPV) abzuschätzen, ist mit aktuellen Screening-Methoden nur eingeschränkt möglich. Das onkogene Potential dieser Infektionen bedingt hauptsächlich die Entstehung zervikaler Karzinome. Während 38% der Frauen im Alter von 20-25 Jahren eine HPV-Infektion aufweisen, entwickelt sich nur bei einem kleinen Prozentsatz der Frauen eine Dysplasie. Ein idealer HPVbasierter Screening-Algorithmus müsste die Aussagekraft besitzen, transiente HPV-Infektionen von solchen mit hohem Dysplasierisiko zu differenzieren. Dieses Projekt untersucht, ob zervikale HPV-Infektionen verschiedener Dysplasiestadien molekularbiologisch anhand zellulärer Biomarkerexpression charakterisiert werden können. Zudem wird eine neuartige Methode der E7-Onkogen-basierten HPV-Genotypisierung evaluiert.
Methoden: Für 218 zervikale Abstriche verschiedener Dysplasiegrade wurde eine quantitative mRNA-Messung (QuantiGene ® 2.0 Assay) für ein Panel 23 zellulärer Biomarker, sowie für das Onkogen E7 von 18 high-risk HPV-Typen durchgeführt. Durch die Techniken der „Branched DNA“- Amplifikation und „Multi-analyte Profiling Beads“ ermöglicht der Assay eine quantitative Messung, deren Sensitivität auf Amplifikation des Signals beruht. Die Auswertung erfolgte durch einen Luminex-Readout. Die Expressionsstärke der Biomarker wurde auf einen Marker der Zellularität (Expressionsstärke des Housekeeping-Gens beta-Aktin, ACTB) relativiert.
Referenzmethode für die Evaluierung der Genotypisierung war die BSGP 5+/6+-MultiPlex
Genotypisierung (MPG). Die Korrelation der zellulären Biomarker mit den pathologisch und klinisch bestimmten Dysplasiegraden wurde errechnet. Auf Basis der signifikant korrelierenden Marker wurden über die statistischen Instrumente der ROC-Analysen und der logistischen Regression Kombinationsmodelle an Trennwerten der Expressionshöhe für die wichtigen Stadien (Infektion, prämaligne Dysplasie, invasives Karzinom) errechnet.
Ergebnisse: Im Vergleich der E7-mRNA-basierten HPV-Genotypisierung mit PCR-basiertem MPG zeigten 55,9% der Proben ein exakt gleiches Ergebnis. 82,8% zeigten ein mindestens teilweise gleiches Ergebnis (bei multiplen HPV-Infektionen mindestens ein identischer HPVTyp). In 88,9% der Fälle war der führende HPV-Typ (stärkste E7-Onkogenexpression) auch in der Referenzmethode positiv. Die Expression der Onkogene E6 und E7, sowie von acht Biomarkern (p16, STMN, p63, ALDH1A1, KRT17, MCM2, Ki67, BIRC5) korrelierte signifikant mit dem Dysplasiegrad. Über ein Berechnungsmodell, welches die Marker E7, ALDH1A1 und MCM2 einschließt, wurde für die Schwelle ≤CIN2/CIN3+ eine AUC von 0,903 und eine Sensitivität von 86,9%, Spezifität von 81,4% für die richtige Zuordnung der Gruppen errechnet.
Für die Schwelle £CIN3/Karzinom wurde über die Marker E7, HPV16E6, STMN1 und KRT17 eine AUC von 0,913 gefunden (Sensitivität: 85,2%, Spezifität: 77,2%).
Interpretation: Als Pilotprojekt zeigt diese Studie, dass zervikale Dysplasien über Biomarker als biologische Entitäten und rein molekulare Methoden charakterisiert werden können. Als nächster Schritt sollte mit einer höheren Fallzahl und prospektiven Design die Reproduzierbarkeit der Daten und somit die Aussagekraft der Marker bestätigt werden
